3,5-диметил-адамантан-1-амин восстанавливает кратковременную синаптическую пластичность посредством изменения функции транспортёров возбуждающих аминокислот у модельных мышей со спиноцеребеллярной атаксией 1 типа

Полный текст

Введение

Спиноцеребеллярная атаксия 1-го типа (СЦА1) относится к группе полиглутаминовых патологий и возникает в результате увеличения числа нуклеотидных повторов CAG в кодирующей части гена атаксина-1 (ATXN1). Для СЦА1 характерна прогрессирующая мозжечковая атаксия с последующим бульбарным параличом и смертью через 10–15 лет после начала заболевания [1]. Патогенез объясняется токсическим действием продукта мутантного гена ATXN1, образующего агрегаты в клетках [2–4]. Исследования показали, что в различных СЦА1-моделях клетки Пуркинье (КП) мозжечка являются основными мишенями [5–7]. В этих же моделях показано нарушение краткосрочной и долгосрочной синаптической пластичности [8].

Глутамат является преобладающим возбуждающим нейромедиатором в центральной нервной системе. Концентрация глутамата в синаптической щели строго контролируется взаимодействием между его высвобождением и клиренсом. Эту функцию выполняет транспортёр возбуждающих аминокислот EAAT1, который является Na⁺-зависимым транспортёром глутамата, экспрессирующимся преимущественно в глиальных клетках мозжечка [9]. Астроцитарные ЕААТ играют важную роль в модуляции глутаматергической возбудимости, обеспечивают обратный захват глутамата из синапса и тем самым защищают нейроны [10].

Нарушение этих процессов приводит к накоплению внеклеточного глутамата, что вызывает эксайтотоксичность и повреждение нейронов [11]. Утечка глутамата из синаптической щели может активировать внесинаптические рецепторы N-метил-D-аспартата (NMDA). Избыточный приток Ca²⁺ через внесинаптические NMDA-рецепторы индуцирует сигнальные каскады, которые запускают запрограммированную клеточную гибель [12].

Перспективным направлением нейропротекторной фармакотерапии различных нейродегенеративных заболеваний является использование антагонистов NMDA-рецепторов [13]. Одним из таких препаратов является 3,5-диметил-адамантан-1-амин (мемантин). Данный препарат одобрен Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США для использования в терапии болезни Альцгеймера [14, 15]. Нейропротекторное действие мемантина изучается и при других патологических процессах: ишемии, мигрени, депрессивноподобном поведении и др. [16–18]. Потенциальные эффекты мемантина при лечении СЦА1 не исследованы. Другим важным аспектом работы NMDA-рецепторов является их участие в формировании синаптической пластичности, лежащей в основе формирования обучения и памяти.

Описанная ранее нами модель, основанная на хронической оптогенетической активации глии Бергмана светочувствительным катионным каналом родопсином-2, продемонстрировала решающую роль нарушения механизма EAAT1 и дальнейшей эксайтотоксичности в патогенезе нейродегенерации мозжечка [6]. Нарушение кратковременной синаптической пластичности в этой модели описано нами ранее [19].

В данной работе мы использовали модель СЦА1 с избирательной экспрессией мутантного атаксина 1 для изучения кратковременной синаптической пластичности при длительном введении животным мемантина.

Цель исследования — изучение молекулярных основ улучшения кратковременной синаптической пластичности при длительном потреблении мемантина модельными СЦА1-мышами.

Материалы и методы

Производство AVV и LVV конструкций

Для достижения большого уровня экспрессии LVV векторов был использован GFAP-промотор [20]. Последовательности непатогенного ATXN1[Q2] (кодирующего человеческий атаксин-1 с 2 повторами глутамина) или патогенного ATXN1[Q85] (с 85 непрерывными повторами глутамина) были совмещены в рамке с последовательностью, кодирующей метку FLAG, на их 5'-концах. Затем конструкции Flag-ATXN1[Q2] и Flag-ATXN1[Q85] переносили в лентивирусный вектор pTYF под контролем усиленного промотора GFAP. Подробная процедура получения вирусного вектора была описана ранее [21]. Титры LVV-GFAP-Flag-ATXN1[Q2] LVV и LVV-GFAP-Flag-ATXN1[Q85] составляли 7 × 10⁹ трансдуцирующих единиц (TU) на 1 мл. LVV хранили при –80ºC и использовали в течение 6 мес.

Моделирование нейродегенерации

Мышей дикого типа (P21) в возрасте 3 нед анестезировали золетилом («Virbac»), 50 мг/кг внутрибрюшинно. Во время хирургических вмешательств мышей согревали с помощью подогреваемой подушки. LVV или фосфатно-солевой раствор (3 мкл) медленно вводили в кору червя мозжечка (долька VI) с помощью шприца Гамильтона на 10 мкл. Стереотаксические координаты относительно брегмы: AP: –2,5 мм, ML: 0 мм, DV: 2 мм. Мышей использовали для дальнейших экспериментов через 9 нед после инъекции, когда экспрессия трансгенного атаксина-1 была выраженной. Часть СЦА1-мышей принимала мемантин в дозе 0,35 мг/кг в день, растворённой в питьевой воде, в течение 9 нед [22].

Иммуногистохимическое исследование

Для иммуногистохимического анализа мышам транскардиально вводили 4% раствор параформальдегида в 0,1 М фосфатном буфере после внутрибрюшинной анестезии золетилом (50 мг/кг). Мозг извлекали и фиксировали в том же растворе в течение ночи. Червь мозжечка нарезали на сагиттальные срезы толщиной 50 мкм. Срезы обрабатывали кроличьими моноклональными антителами против EAAT1 (1 : 500; «Cloud Clone Corp.»), а затем визуализировали с помощью конъюгированного с Alexa Fluor 488 ослиного антикроличьего IgG (1 : 1000; «Life Technologies»). Антитела растворяли в фосфатно-солевом растворе, содержащем 2% нормальной ослиной сыворотки, 0,1% Тритон Х-100 и 0,05% NaN³. Для сравнения были получены конфокальные флуоресцентные изображения срезов мозжечка из соответствующей области с помощью микроскопа «FV10i» («Olympus»). Изображения записывали в виде Z-стеков с использованием объектива ×10 и разрешения 1024 × 1024. Преобразованные в чёрно-белые микрофотографии анализировали с помощью программного обеспечения «ImageJ». Для предотвращения получения ложноположительных результатов мы использовали фильтр отсечения анти-ЕААТ1-сигнала в 30% от максимальной интенсивности свечения. Для измерения ЕААТ1-положительной области выбирали пятна более 30 пикселей.

Метод локальной фиксации потенциала

После достижения глубокой анестезии золетилом мышь декапитировали, мозг извлекали и быстро помещали в ледяной раствор Рингера, насыщенный 95% O₂ + 5% CO₂. Парасагиттальные срезы (250 мкм) червя мозжечка получали с использованием вибротома «Microtom CU65» («Thermo Scientific»). Срезы нарезали в растворе Рингера (в мМ): 234 сахарозы, 26 NaHCO₃, 2,5 KCl, 1,25 NaH₂PO₄, 11 глюкозы, 10 MgSO₄ и 0,5 CaCl₂ при 4ºC с постоянной подачей смеси 95% O₂ + 5% CO₂ [6]. Срезы хранили во внеклеточном растворе, содержащем (в мМ): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 1,25 NaH₂PO₄, 26 NaHCO₃, 10 D-глюкозы и 0,05–0,10 пикротоксина. Этот раствор непрерывно насыщали смесью 95% O₂ и 5% CO₂ при комнатной температуре в течение 1 ч до начала электрофизиологических экспериментов.

Для электрофизиологических записей в режиме «whole cell» мы использовали внутриклеточный раствор, содержащий (в мМ): 140 Cs-глюконат, 8 KCl, 10 HEPES, 1 MgCl₂, 2 MgATP, 0,4 NaGTP, 0,2 EGTA (pH 7,3). Анализ электрофизиологических данных проводили с использованием программного обеспечения «pClamp10» («Molecular Devices»), «Patchmaster» («HEKA») и «Clampfit 10.5» («Axon Instruments»). Напряжение мембраны КП фиксировали на уровне –70 мВ. Для записи возбуждающих постсинаптических токов (ВПСТ) при раздражении параллельных волокон (ПВ) стимулирующий электрод помещали в молекулярный слой коры мозжечка. Оценку постоянной релаксации ВПСТ (характерное время спада τ) производили в программе «ClampFit» аппроксимацией кривой ВПСТ экспоненциальной функцией от пикового значения (А) до конца записи сигнала.

Для анализа кратковременной синаптической пластичности (синаптически вызванного подавления возбуждения — synaptically evoked suppression of excitation, SSE) напряжение мембраны КП фиксировали на –70 мВ. Запись контрольной ПВ-ВПСТ осуществляли с частотой 0,2 Гц в течение 40 с. Чтобы вызвать SSE, мы применили высокочастотную стимуляцию ПВ (15 импульсов с частотой 100 Гц) для активации mGluR-опосредованного каскада сигналов в КП. Усреднённые амплитуды ПВ-ВПСТ за 10 с нормализовали к их исходным значениям, которые представляли собой средние значения до вызывания SSE. ПВ-ВПСТ далее регистрировали в течение 100 с после стимуляции.

Статистические методы и обработка данных

Данные выражали как средние значения ± стандартная ошибка среднего с доверительным интервалом 95%. Для проведения статистического анализа мы использовали базовые статистические функции бесплатной программы с открытым исходным кодом R. Различия между отдельными группами оценивали с помощью модели ANOVA и критерия Тьюки–Крамера, который применим для корректировки значений p, если выборки имеют неравный размер. Различия считали значимыми при p < 0,05.

Результаты

Длительное применение мемантина влияет на экспрессию EAAT1

Изменения в коре мозжечка при таргетной экспрессии мутантного атаксина 1 в глии Бергмана были подробно описаны нами ранее [23]. В этой работе мы вводили мемантин (0,35 мг/кг) модельным СЦА1 мышам в течение 9 нед начиная с 21-го дня после рождения для купирования нейродегенеративного процесса.

Реактивация глии Бергмана посредством мутантного атаксина 1 существенно влияла на экспрессию EAAT1 у мышей. У мышей ATXN1[Q85] наблюдалось снижение экспрессии: площадь, занимаемая положительным анти-EEAT1-сигналом, относительно общей площади снимка составила 15,2 ± 0,5% (исследованы 9 зон у 3 мышей — area/number (a/n) = 9/3 по сравнению с 17,0 ± 0,3% (a/n = 8/3) у мышей, экспрессирующих ATXN1[Q2] (p = 0,007; рис. 1, А, В). Хроническое введение мемантина увеличивало площадь положительного сигнала анти- ЕААТ1 до 17,5 ± 0,1% (a/n = 11/3) по сравнению с мышами, экспрессирующими ATXN1[Q85], без хронического введения мемантина (p = 0,002).

Более значимым показателем было увеличение количества экспрессируемых анти-ЕААТ1 положительных пятен у СЦА1-мышей после долговременного потребления мемантина — 27,1 ± 1,3 относительно не принимавших мемантин мышей ATXN1[Q85] (21,0 ± 2,1) и ATXN1[Q2] (18,7 ± 1,7; р = 0,02 и р = 0,0001 соответственно; рис. 1, А, С). Эти данные указывают на то, что мемантин изменяет экспрессию ЕААТ1 через увеличение площади и количества транспортёров на мембране глии Бергмана коры мозжечка.

Длительное применение мемантина влияет на синаптическую передачу в синапсах параллельных волокон с клетками Пуркинье

Изменение экспрессии ЕААТ1 изменяет обратный захват глутамата из синаптической щели, что в свою очередь влияет на синаптическую передачу. Для оценки влияния длительного применения мемантина на синаптическую передачу и пластичность мы исследовали электрофизиологические свойства КП.

Постоянная времени спада (τ) амплитуды ПВ-ВПСТ в КП СЦА1-мышей, не принимавших мемантин, статистически не отличалась от контроля и составляла 14,5 ± 1,0 мс^–1 (исследованы 18 клеток у 4 мышей — cells/number (с/n) = 18/4) при экспрессии ATXN1[Q2] и 15,1 ± 1,5 мс^–1 при экспрессии ATXN1[Q85] (c/n = 19/4; p = 0,75; непарный t-критерий). Длительное введение мемантина увеличивало τ амплитуды ПВ-ВПСТ у СЦА1-мышей до 21,0 ± 2,3 мс^–1 (c/n = 14/4; p = 0,048; рис. 2).

Экспрессия мутантного атаксина 1 избирательно в глии Бергмана влияет на SSE

Медленный спад ПВ-ВПСТ может свидетельствовать о долгом воздействии глутамата на постсинаптические рецепторы в силу его накопления из-за нарушения обратного захвата. Это может создавать предпосылки к выходу глутамата за пределы синаптической щели и активации перисинаптических рецепторов, таких как mGluR1. В связи с этим мы исследовали определённый тип кратковременной синаптической пластичности, связанный с активацией mGluR1-сигнализации в КП. Тетанус-стимуляция ПВ вызывает активацию mGluR1 и связанное с ним локальное повышение содержания Ca²⁺ в КП. Это приводит к синтезу эндоканнабиноидов и ведёт к ретроградному подавлению высвобождения глутамата из пресинаптических терминалей ПВ (SSE) [24–27].

В присутствии блокатора mGluR1, 25 мкМ СРССОЕt сразу после тетанус-стимуляции амплитуда ПВ-ВПСТ увеличивалась с 37,6 ± 5,9 до 63,5 ± 5,0% (с/n = 7/3; р = 0,026, парный t-критерий; рис. 3).

После тетанус-раздражения у мышей, экспрессирующих ATXN1[Q85], амплитуда ПВ-ВПСТ увеличивалась (116,1 ± 8,9% (n = 8/3)). Подавления амплитуды не наблюдалось, тогда как у мышей, экспрессирующих ATXN1[Q2], амплитуда уменьшалась после стимуляции и оставалась уменьшенной в течение всего периода записи (79,1 ± 14,1%; n = 8/3; p < 0,01; рис. 4). Длительное введение мемантина восстановило SSE: амплитуда после стимуляции снизилась (44,9 ± 8,5%; n = 9/3; p < 0,001 по сравнению с мышами, не принимавшими мемантин; динамика восстановления амплитуд была подобна тем, что наблюдалась у мышей, экспрессирующих ATXN1[Q2] (рис. 4).

Обсуждение

Мы использовали СЦА1-модель с таргетной экспрессией LVV GFAP-ATXN1[Q85]-Flag в глии Бергмана [23] для оценки влияния мемантина на процессы, участвующие в формировании кратковременной синаптической пластичности. Мемантин применялся длительно в течение 9 нед в дозе 0,35 мг/кг в сутки.

Ранее нами показано уменьшение экспрессии и функции транспортёров возбуждающих аминокислот EAAT1 в оптогенетической модели нейродегенерации мозжечка [6]. Данные изменения связаны с нарушением обратного захвата глутамата астроцитами из синаптической щели и хорошо документированы при различных нейродегенеративных состояниях [13, 14, 16].

В нашей СЦА1-модели наблюдался схожий эффект — уменьшение экспрессии ЕААТ1 в коре мозжечка. Мемантин восстанавливал уровень экспрессии до контрольных значений в обеих моделях нейродегенерации ([6]; рис. 1, А, В). Имеются данные о том, что экспрессия белка EAAT1 активируется экзогенным глутаматом [10, 28]. S. Duan и соавт. обнаружили, что механизм этого опосредованного глутаматом увеличения функции EAAT1 обусловлен индукцией поверхностной экспрессии EAAT1 в культурах астроцитов мыши без изменения экспрессии общего белка-транспортёра [29]. Вполне вероятно, что такой механизм повышения ЕААТ1 обеспечивает защиту нейронов от чрезмерного количества глутамата. Мы заметили увеличение количества EAAT1-положительных пятен у животных, получавших мемантин (рис. 1, А, С). Это может указывать на изменение кластеризации или транспорта этих переносчиков к мембране в зависимости от присутствия глутамата в синаптической щели. Последующие исследования важны для подтверждения этой гипотезы.

 

Рис. 1. Экспрессия ЕААТ1 у животных, получавших и не получавших мемантин (mem). А — флуоресцентные микрофотографии срезов коры мозжечка, меченные анти-EAAT1 (слева) и обработанные с помощью программы «ImageJ» (справа). Мерные шкалы — 50 и 5 мкм соответственно; В — доля области, занимаемой анти-ЕААТ1-положительным сигналом; С — количество анти-EAAT1-положительных пятен. а/n — количество исследованных зон/животных. **p < 0,01.

Fig. 1. EAAT1 expression in animals receiving and not receiving memantine. A — fluorescent microphotographs of the cerebellar cortex slices labeled with anti-EAAT1 (left panel). The images processed with ImageJ software (right panel). Chart scales are 50 and 5 μm respectively. B — proportion of anti-EAAT1 positive signal area. C — total amount of anti-EAAT1 positive spots. а/n — number of examined areas/animals. **p < 0.01.

 

В то же время исследования показали, что введение мемантина снижает активность захвата глутамата как в лобно-теменной коре, так и в гиппокампе, не влияя на экспрессию переносчиков возбуждающих аминокислот [30].

Возможно, наблюдаемое увеличение экспрессии EAAT1 является компенсаторным механизмом и может быть объяснено ухудшением функции данного переносчика. Нарушение функции EAAT1 также подтверждает наблюдаемое нами увеличение τ ПВ-ВПСТ у СЦА1-мышей при длительном введении мемантина (рис. 2).

 

Рис. 2. Мемантин (mem) увеличивает постоянную времен спа- да (τ) амплитуды ПВ-ВПСТ в КП СЦА1-мышей. Представлена сводная диаграмма среднего времени спада ПВ- ВПСТ. Справа от графика расположены репрезентативные кривые. c/n — количество клеток/животных. *p < 0,05.

Fig. 2. Memantine increases the constant decay time (τ) of PF-EPSC amplitude in the PC of SCA1 mice. Summary diagram of the PF-EPSCs mean constant decay time (τ). Representative curves are presented on the right panel. c/n is the
number of cells/animals (*p < 0.05).

 

Одним из проявлений изменения экспрессии генов и результатом реактивации астроглии при СЦА1 является нарушение передачи сигналов глутамата. Отмечается снижение количества mGluR1 на мембранах КП, а также симпортёров глутамата EAAT4 и транспортёра глутамата и аспартата EAAT1 в глии Бергмана [31–34]. В результате нарушается ряд электрофизиологических функций КП, что влияет на процессы двигательного обучения и синаптической пластичности [33, 34].

Наиболее исследованными видами синаптической пластичности в синапсах ПВ с клетками Пуркинье являются облегчение парных импульсов, подавление импульса после деполяризации, SSE и долговременная депрессия (LTD). Среди них mGluR-зависимыми являются SSE и LTD, однако LTD вызывается сочетанным триггером: раздражением ПВ (активацией mGluR) и деполяризацией клетки Пуркинье [35]. Тем самым исследование данного типа синаптической пластичности не позволяет точно выявить облегчение mGluR-сигнализации в клетках Пуркинье из-за обязательного второго компонента раздражителя (деполяризации мембраны). LTD не вызывается не только в присутствии блокаторов mGluR, но и в отсутствие деполяризации мембраны [36]. Поэтому была исследована SSE как процесс, всецело зависящий от активации mGluR [25]. Ранжирование усиления mGluR-сигнализации можно косвенно, но точно определить с помощью восстановления кривой ПВ-ВПСТ после тетанус-стимуляции. При длительном применении мемантина увеличение количества нейромедиатора в синаптической щели позволяет глутамату накапливаться и активировать mGluR1, что способствует восстановлению SSE (рис. 4).

 

Рис. 3. Нарушение SSE после подавления mGluR1-зависимого пути передачи сигнала в присутствии СРССОЕt. А — динамика амплитуд ПВ-ВПСТ после тетанус-стимуляции ПВ. Над графиком представлены репрезентативные кривые токов непосредственно до стимуляции (точка 1, время –10 с на графике) и сразу после стимуляции (точка 2, время 0 с на графике). В — нормированные к достимуляционному уровню амплитуды непосредственно после стимуляции (в точке 2). с/n — количество клеток/животных. *p < 0,05.

Fig. 3. The SSE impairment after the inhibition of mGluR1-dependent signaling pathway in the presence of СРССОЕt. A — changes of PF-EPSC amplitudes after tetanic PF stimulation. Representative PF-EPSC curves above the chart: recorded immediately before the stimulation (point 1, 10 sec on the time axis) and after the stimulation (point 2, 0 sec on the time axis). B — amplitudes normalized to the pre-stimulation level immediately after the stimulation (point 2). с/n is the number of cells/animals. *p < 0.05.

 

Рис. 4. Восстановление SSE у СЦА1-мышей после длительного применения мемантина (mem). А — динамика амплитуд ВПСТ после тетанус-стимуляции ПВ. Над графиком представлены репрезентативные кривые токов непосредственно до стимуляции (точка 1, время –10 с на графике) и сразу после стимуляции (точка 2, время 0 с на графике). В — нормированные к достимуляционному уровню амплитуды непосредственно после стимуляции (в точке 2). с/n — количество клеток/животных. **p < 0,01; ***p < 0,001.

Fig. 4. SSE restoration in SCA1 mice after long-term memantine administration (mem). A — changes of PF-EPSC amplitudes after tetanic PF stimulation. Representative PF-EPSC curves above the chart: recorded immediately before the stimulation (point 1, 10 s on the time axis) and after the stimulation (point 2, 0 s on the time axis). B — amplitudes normalized to the pre-stimulation level immediately after the stimulation (point 2). с/n is the number of cells/animals.
**p < 0.01; ***p < 0.001.

 

Данный механизм в виде уменьшения обратного захвата глутамата из синаптической щели ПВ с клетками Пуркинье обусловлен долговременным эффектом мемантина. Это не приводит к нейродегенерации, поскольку NMDA-рецепторы остаются заблокированными мемантином. Однако увеличение содержания глутамата в синаптической щели позволяет ему достигать перисинаптических mGluR1 и индуцировать синаптическую пластичность, такую как SSE (рис. 4). Понимание этого процесса позволит назначать препараты с осознанием того, как они могут влиять на глутаматергическую систему.

Достижение баланса высвобождения и использования глутамата может стать ключом к лечению многих нейродегенеративных заболеваний. Понимание этих механизмов имеет решающее значение для планирования будущих клинических исследований.

Заключение

При нейродегенеративных заболеваниях мозжечка, в частности СЦА1, нарушение кратковременной синаптической пластичности, такой как SSE, в синапсах КП связано с деградацией mGluR на шипиках дендритов. В этой работе мы показали, что мемантин уменьшает обратный захват нейромедиатора посредством модуляции работы ЕААТ1 и усиливает mGluR-сигнализацию внутри КП. Наши исследования дополняют картину нарушений механизмов развития синаптической пластичности в нейронах мозжечка, понимание которых является необходимым элементом стратегии терапии нейродегенеративных состояний разного генеза.

Об авторах

Ольга Сергеевна Белозор

Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого

Email: shuvaevan@krasgmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-8384-5962

ассистент каф. биологической химии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии

Россия, Красноярск

Александр Александрович Васильев

Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта

Email: shuvaevan@krasgmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-9288-842X

н.с. Научного и образовательного кластера МЕДБИО

Россия, Калининград

Александра Геннадьевна Милейко

Сибирский федеральный университет

Email: shuvaevan@krasgmu.ru
ORCID iD: 0009-0003-2623-0074

студент биологического факультета

Россия, Красноярск

Людмила Дмитриевна Мосина

Сибирский федеральный университет

Email: shuvaevan@krasgmu.ru
ORCID iD: 0009-0001-2839-6161

студент биологического факультета

Россия, Красноярск

Илья Геннадьевич Михайлов

Сибирский федеральный университет

Email: shuvaevan@krasgmu.ru
ORCID iD: 0009-0004-0022-1898

студент биологического факультета

Россия, Красноярск

Андрей Николаевич Шуваев

Сибирский федеральный университет

Email: shuvaevan@krasgmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-3887-1413

к.ф.-м.н., зав. каф. медико-биологических систем и комплексов

Россия, Красноярск

Антон Николаевич Шуваев

Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого; Сибирский федеральный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: shuvaevan@krasgmu.ru
ORCID iD: 0000-0003-0078-4733

к.м.н., руководитель НИИ молекулярной медицины и патобиохимии

Россия, Красноярск; Красноярск

Список литературы

Дополнительные файлы