Оценка активности митохондриальных генов в культурах дофаминергических нейронов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток от пациентов с болезнью Паркинсона

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Введение. Технологии культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) предоставляют возможность для моделирования нейродегенеративных заболеваний in vitro и поиска их ранних биомаркеров.

Цель исследования — оценить активность генов, вовлечённых в функционирование митохондрий, на культурах дофаминергических нейронов — производных ИПСК — при генетических формах болезни Паркинсона (БП).

Материалы и методы. Культуры дофаминергических нейронов были получены путём клеточного репрограммирования от пациентов с БП, являющихся носителями мутаций в генах SNCA и LRRK2, а также от здорового донора (контроль). С помощью технологии мультиплексного профилирования генной экспрессии на платформе «NanoString» оценивали экспрессию 112 генов, участвующих в структурно-функциональной организации митохондрий и собранных в специальную «митохондриальную» панель.

Результаты. При сравнении характеристик нейронов, полученных от пациентов с генетическими формами БП и в контроле, выявлены различия в активности генов, продукты которых связаны с работой митохондриального дыхательного комплекса, ферментами цикла трикарбоновых кислот, биосинтезом аминокислот, окислением жирных кислот, метаболизмом стероидов, гомеостазом кальция в клетке, утилизацией свободных радикалов. Ряд генов показал также дифференцированную экспрессию в культурах с мутациями SNCA и LRRK2; в дополнение к указанным выше функциям данные гены контролируют митофагию, синтез митохондриальной ДНК, окислительные реакции, процессы детоксикации клетки и апоптоз, метаболизм белков и нуклеотидов.

Заключение. Выявленные в настоящем пилотном исследовании изменения экспрессии генных сетей подтверждают роль нарушений митохондриального гомеостаза в молекулярном патогенезе БП и могут способствовать разработке биомаркеров и поиску новых терапевтических мишеней при SNCA- и LRRK2-ассоциированных формах заболевания.

Полный текст

Введение

Болезнь Паркинсона (БП) является распространённым возрастным нейродегенеративным заболеванием, поражающим преимущественно дофаминергические нейроны в компактной части чёрной субстанции (ЧС) и приводящим к сложному комплексу моторных и немоторных клинических симптомов. По предварительным прогнозам, к 2040 г. количество лиц, страдающих данным недугом, может достигнуть 12,9 млн [1]. Современные методы лечения БП носят симптоматический характер и не предотвращают прогрессирование заболевания. Первые моторные симптомы БП проявляются при гибели около 60% дофаминергических нейронов ЧC, поэтому инициация терапии происходит весьма поздно [2]. Современные технологии получения и культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), полученных от пациентов, открыли новые возможности для изучения патологических механизмов нейродегенеративных заболеваний. Модели БП in vitro и нейроны, полученные из ИПСК пациентов с мутациями в каузальных генах БП, оказались высокоинформативными в выяснении молекулярного патогенеза нейродегенеративного процесса [3]. Важно отметить, что модели на основе ИПСК помогут выявлять самые ранние изменения в морфологии и функциональности нейронов и выявлять динамику развивающейся патологии на самых ранних, досимптомных стадиях.

Интенсивное развитие молекулярных технологий, позволяющих эффективно и с высокой производительностью осуществлять качественную и количественную оценку различных генетических показателей, вывело исследования в области маркеров прогрессирования заболевания на новый уровень. Одной из таких технологий является мультиплексная технология «NanoString nCounter» («NanoString Technologies»), позволяющая осуществлять единовременное измерение экспрессии сотен генов-мишеней в одной реакции [4, 5]. Преимуществами данной технологии по сравнению с традиционными методами анализа экспрессии генов являются высокая автоматизация, производительность и воспроизводимость полученных результатов. Чувствительность метода сопоставима с ПЦР в реальном времени [6]. В основу рассматриваемой технологии измерения положено мечение исследуемых мишеней уникальными цветовыми штрих-кодами, прикреплёнными к мишень-специфичным зондам, с их последующей детекцией [7]. За счёт исключения из технологического процесса предварительных этапов обратной транскрипции и амплификации [8] и, как следствие, связанных с ними ошибок метод демонстрирует высокий уровень точности и чувствительности, позволяющий использовать малые концентрации и объёмы исходного материала [4, 5].

В настоящее время при анализе механизмов развития БП значительное внимание уделяется исследованию динамики митохондрий [9, 10]. В нашей работе мы использовали технологию мультиплексного профилирования генной экспрессии с помощью шрихкодирования на платформе «NanoString» для оценки активности генов, вовлечённых в функционирование митохондрий, на культурах дофаминергических нейронов — производных ИПСК — у пациентов с генетическими формами БП.

Материал и методы

Получение клеточных культур

Кожные биоптаты для исследования были получены от 3 испытуемых: 2 пациентов с известными генетическими формами БП и клинически здорового донора. Один из пациентов с БП был носителем гетерозиготной дупликации экзонов 2–7 гена SNCA, второй — носителем гетерозиготной точковой мутации G2019S в гене LRRK2. Все пациенты были ознакомлены с условиями проведения исследования и подписали информированное согласие на участие в нем; проведение исследования было одобрено локальным этическим комитетом ФГБНУ «Научный центр неврологии» (протокол № 11/12 от 12.09.2012).

После получения гомогенных культур первичных фибробластов кожи клетки были репрограммированы в ИПСК. Для репрограммирования фибробластов использовали вирус Сендай, т.к. данный метод не вызывает интеграции репрограммирующих факторов и вирусной ДНК в геном. Все линии ИПСК культивировали в среде mTeSR («STEMCELL Technologies») на подложках, покрытых Matrigel. Репрограммирование фибробластов и дифференцировку ИПСК в нейрональные предшественники и далее в культуры нейрональных клеток, обогащённые дофаминергическими нейронами, проводили, как описано ранее [11].

Выделение РНК из культуры нейронов

Тотальную РНК из зрелых нейронов линий пациентов и здорового донора выделяли с помощью набора «Total RNA purification kit» («Norgen») согласно рекомендации производителя. Количественно РНК оценивали в спектрофотометре «Nanodrop 2000» («Thermo Scientific»). РНК была использована немедленно или хранилась до экспериментов при температуре –80ºC.

Анализ экспрессии генов

Анализ экспрессии генов проводили с помощью методики «NanoString» («NanoString Technologies»). В исследовании использовалась пользовательская панель, содержащая 12 генных сетей, ассоциированных с работой митохондриального аппарата. Панель включает 112 генов, подобранных на основе данных литературы об их участии в структурно-функциональной организации митохондрий, а также 5 генов «домашнего хозяйства» в качестве контрольных. После гибридизации тотальной РНК (100 нг) с набором специфических флуоресцентных меток образцы загружали в подготовительную станцию «nCounter Analysis System» («NanoString Technologies») и анализировали согласно протоколу производителя.

Данные обрабатывали с помощью пакета программного обеспечения «nSolver v. 4.0». Нормализацию первичных данных проводили по референсным генам «домашнего хозяйства»: β-актину (NM_001101.2), GAPDH (NM_002046.3), HPRT1 (NM_000194.1), RPL19 (NM_000981.3) и β-тубулину (NM_178014.2). Данные, полученные с помощью системы nCounter, выражены в единицах, отражающих концентрацию таргетных молекул РНК в образце.

Результаты

Для ИПСК пациентов с БП и здорового донора были проведены все необходимые по международным стандартам тесты на экспрессию маркеров плюрипотентности и экспрессию генов, характерных для плюрипотентных клеток; подтверждены также нормальность кариотипа и способность к образованию эмбриоидных телец и производных 3 зародышевых листков. ИПСК от пациентов и здорового человека запускались в дифференцировку до нейрональных предшественников параллельно. Выбор линии был обусловлен результатами проведённых тестов. Линии ИПСК, демонстрирующие в тесте на спонтанную дифференцировку in vitro тенденцию к преимущественному образованию нейральных производных, были использованы в первую очередь. Терминальную дифференцировку в дофаминергические нейроны проводили в два этапа согласно протоколам, отработанным ранее [12].

Далее были проанализированы изменения в профилях экспрессии митохондриальных генов для 3 культур нейронов, полученных из ИПСК, на платформе «NanoString». Оценивали экспрессию 112 генов, собранных в специальную «митохондриальную» панель «NanoString Human». Проведённый сравнительный анализ выявил для 13 генов однонаправленные изменения уровня экспрессии в виде её снижения (рисунок) в культурах обоих пациентов с генетическими формами БП в сравнении с экспрессией данных генов в контрольных нейронах. Для изученных генетических форм БП оказалось характерным угнетение экспрессии генов, имеющих отношение к процессам окислительного фосфорилирования, циклу трикарбоновых кислот, биосинтезу аминокислот, окислению жирных кислот, метаболизму стероидов, поддержанию гомеостаза кальция в клетке, утилизации свободных радикалов [13–15].

 

Снижение экспрессии ряда генов, ассоциированных с функционированием митохондрий, в нейронах пациентов с генетическим формами БП.

Decreased expression of some genes associated with mitochondrial dynamics and functions in neurons derived from patients with genetic form of PD.

 

Для ряда генов нами была выявлена дифференцированная экспрессия в культурах нейронов, полученных от больных БП с мутациями в генах LRRK2 и SNCA. В нейронах c мутацией в гене LRRK2 наблюдалось повышение экспрессии для 10 генов и снижение экспрессии для 16 генов по сравнению с контрольной культурой и нейронами с мутацией SNCA (табл. 1). Продукты выявленных генов с дифференцированной экспрессией участвуют в функционировании дыхательной цепи митохондрий, цикле трикарбоновых кислот, митофагии, процессинге и метаболизме белков в клетке, метаболизме нуклеотидов и витаминов, трансмембранном переносе железа и других субстратов [16, 17].

 

Таблица 1. Изменения экспрессии генов в культуре нейронов с мутацией в гене LRRK2

Table 1. Gene expression changes in the neurons with the LRRK2 gene mutation

Метаболический путь

Metabolic pathway

Гены

Gene

Уровень экспрессии генов

Gene expression level

Дыхательная цепь митохондрий

Mitochondrial respiratory chain

SDHA

Повышен

Increased

CYCS, ATP5E, ATPAF2, NDUFA1, NDUFB9, NDUFS4

Понижен

Decreased

Транспорт клеточных субстратов

Transmembrane transport of substrates

SLC25A12, SLC25A13, SLC25A

FXN, TMLHE

Повышен

Increased

Цикл трикарбоновых кислот

Tricarboxylic acid cycle

FH

Повышен

Increased

Метаболизм аминокислот, нуклеотидов и витаминов

Metabolism of the proteins, nucleotides, and vitamins

AMT, PCCA, TMLH

Повышен

Increased

GATM, GCDH, PCCB, HADHA

Понижен

Decreased

Белки теплового шока

Heat shock proteins

HSPA1A, HSPA4L, HSPA6, HSPB1

Понижен

Decreased

Митофагия

Mitophagy

PINK1

Понижен

Decreased

Трансляция белков

Protein translation

TSFM

Понижен

Decreased

 

В нейронах, полученных от пациента с мутацией в гене SNCA, наблюдалось повышение экспрессии для 44 генов и снижение экспрессии для 21 гена по сравнению с контролем и нейронами с мутацией в гене LRRK2 (табл. 2). Повышение экспрессии касалось генов, продукты которых участвуют в окислительном фосфорилировании, митофагии, репликации и репарации митохондриальной ДНК, цикле трикарбоновых кислот, процессинге белков, белковом и липидном метаболизме, а также контроле окислительных реакций, апоптозе и защите от нейротоксичности. Выявленные гены со сниженной экспрессией вовлечены, главным образом, в сортинг и сборку белков, метаболизм белков и нуклеотидов [18–23].

 

Таблица 2. Изменения экспрессии генов в культуре нейронов с мутацией в гене SNCA

Table 2. Gene expression changes in the neurons with the SNCA gene mutation

Метаболический путь

Metabolic pathway

Гены

Gene

Уровень экспрессии генов

Gene expression level

Дыхательная цепь митохондрий

Mitochondrial respiratory chain

COX15, COX6B1, CYP11B2, CYP27A1, ETFA, MT-ATP6, MT-ATP8, MT-CO1, MT-CO2, MT-CO3, MT-CYB, MT-ND1, MT-ND2, MT-ND3, MT-ND4, MT-ND4L, MT-ND5, MT-ND6, NDUFA10, NDUFA11, NDUFB3, NDUFS2, NDUFS3, NDUFS6, NDUFV1, SDHB, SDHC, SDHD

Повышен

Increased

UQCRB, COX10

Понижен

Decreased

Транспорт клеточных субстратов

Transmembrane transport of substrates

ABCB6, CPT1A, SLC25A20, SLC25A4, TIMM44

Повышен

Increased

SLC25A15, SLC25A22, SLC9A6

Понижен

Decreased

Цикл трикарбоновых кислот

Tricarboxylic acid cycle

SUCLA2, PDHB, PDHX

Повышен

Increased

Митофагия

Mitophagy

GSR

Повышен

Increased

HIF-1α, Mfn2, OPA1

Понижен

Decreased

Метаболизм аминокислот

Amino acid metabolism

HADHB

Повышен

Increased

ALDH18A1, NDUFV2, SARDH

Понижен

Decreased

Белки теплового шока

Heat shock proteins

HSPA9

Повышен

Increased

HSPA14

Понижен

Decreased

Репликация и репарация митохондриальной ДНК

Replication and repair of mitochondrial DNA

DGUOK, POLG, C10orf2

Понижен

Decreased

Трансляция белков

Protein translation

TUFM, MRPL3

Понижен

Decreased

Синтез гема

Gem synthesis

PPOX

Понижен

Decreased

 

Обсуждение

Митохондрии играют ключевую роль в регуляции клеточной биоэнергетики, участвуют посредством многочисленных сигнальных путей в развитии, пластичности и дифференцировке нейронов, а также реализации механизмов апоптоза [24].

В нашем пилотном исследовании, благодаря использованию платформы «NanoString», была оценена экспрессия более 100 генов, ассоциированных с работой митохондриального аппарата. При сравнении характеристик нейронов, полученных от пациентов с генетическими формами БП и здорового донора, были выявлены различия в экспрессии генов, продукты которых связаны с активностью окислительного фосфорилирования, циклом трикарбоновых кислот, биосинтезом аминокислот, окислением жирных кислот, метаболизмом стероидов, гомеостазом кальция в клетке, утилизацией свободных радикалов. Ряд генов показал также дифференцированную экспрессию в культурах с мутациями SNCA и LRRK2, при этом, помимо ряда уже указанных выше функций, данные гены контролируют митофагию, синтез митохондриальной ДНК, окислительные реакции, процессы детоксикации клетки и апоптоз, метаболизм белков и нуклеотидов.

Выявленные изменения экспрессии генных сетей подтверждают роль нарушений митохондриального гомеостаза в молекулярном патогенезе БП и могут способствовать разработке биомаркеров и поиску новых терапевтических мишеней при SNCA- и LRRK2-ассоциированных формах заболевания.

Источник финансирования. Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 19-15-00320).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов: Ветчинова А.С. — курирование данных, анализ данных, проведение исследования; Капкаева М.Р., Муджири Н.М. — проведение исследования; Иллариошкин С.Н. — руководство научно-исследовательской работой, идеи, формулирование и проработка целей и задач.

Ethics approval. Authors confirm compliance with institutional and national standards for the use of laboratory animals in accordance with «Consensus Author Guidelines for Animal Use» (IAVES, 23 July 2010). The research protocol was approved by the Local Ethics Committee of the Research Center of Neurology (protocol No. 5-5/22, June 1, 2022).

Source of funding. The study was supported by the Russian Science Foundation grant No. 19-15-00320.

Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.

Author contribution: Vetchinova A.S. — curation of data, data analysis, research; Kapkaeva M.R., Mujiri N.M. — conducting research; Illarioshkin S.N. — management of research work, ideas, formulation and elaboration of goals and objective

×

Об авторах

Анна Сергеевна Ветчинова

ФГБНУ «Научный центр неврологии»

Автор, ответственный за переписку.
Email: annvet@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3367-5373

к.б.н., с.н.с. лаб. нейробиологии и тканевой инженерии отдела молекулярных и клеточных механизмов нейропластичности Института мозга 

Россия, Москва

Марина Рафаиловна Капкаева

ФГБНУ «Научный центр неврологии»

Email: annaly-nevrologii@neurology.ru
ORCID iD: 0000-0002-2833-2897

н.с. лаб. нейробиологии и тканевой инженерии отдела молекулярных и клеточных механизмов нейропластичности Института мозга 

Россия, Москва

Наталья Мурадовна Муджири

ФГБНУ «Научный центр неврологии»

Email: Mudzhirinm@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3835-6622

м.н.с. лаб. нейроморфологии Института мозга 

Россия, Москва

Сергей Николаевич Иллариошкин

ФГБНУ «Научный центр неврологии»

Email: annaly-nevrologii@neurology.ru
ORCID iD: 0000-0002-2704-6282

д.м.н., профессор, академик РАН, заместитель директора по научной работе, директор Института мозга 

Россия, Москва

Список литературы

  1. Dorsey E.R., Bloem B.R. The Parkinson pandemic — a call to action. JAMA Neurol. 2018;75:9–10. doi: 10.1001/jamaneurol.2017.3299
  2. Chaudhuri K.R., Healy D.G., Schapira A.H. Non-motor symptoms of Parkinson’s disease: diagnosis and management. Lancet Neurol. 2006;5:235–2454. doi: 10.1016/S1474-4422(06)70373-8.
  3. MacDougall G., Brown L.Y., Kantor B. et al. The path to progress preclinical studies of age-related neurodegenerative diseases: a perspective on rodent and hiPSC-derived models. Mol. Ther. 2021;29(3):949–972. doi: 10.1016/j.ymthe.2021.01.001
  4. Geiss G.K., Bumgarner R.E., Birditt B. et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nat. Biotechnol. 2008;26(3):317–325. doi: 10.1038/nbt1385.
  5. Gentien D., Piqueret-Stephan L., Henry E. et al. Digital multiplexed gene expression analysis of mRNA and miRNA from routinely processed and stained cytological smears: a proof-of-principle study. Acta Cytol. 2021;65(1):88–98. doi: 10.1159/000510174
  6. Vazquez-Prokopec G.M., Bisanzio D., Stoddard S.T. et al. Using GPS technology to quantify human mobility, dynamic contacts and infectious disease dynamics in a resource-poor urban environment. PLoS One. 2013;8(4):e58802. doi: 10.1371/journal.pone.0058802
  7. Geiss G.K., Bumgarner R.E., Birditt B. et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nat. Biotechnol. 2008;26(3):317–325. doi: 10.1038/nbt1385
  8. Yu L., Bhayana S., Jacob N.K., Fadda P. Comparative studies of two generations of NanoString nCounter System. PLoS One. 2019;14(11):e0225505. doi: 10.1371/journal.pone.0225505
  9. Osellame L.D., Duchen M.R.. Defective quality control mechanisms and accumulation of damaged mitochondria link Gaucher and Parkinson diseases. Autophagy. 2013;9(10):1633–1635. doi: 10.4161/auto.25878
  10. Сухоруков В.С., Воронкова А.С., Литвинова Н.А. и др. Роль индивидуальных особенностей митохондриальной ДНК в патогенезе болезни Паркинсона. Генетика. 2020;56(4):392–400. Sukhorukov V.S., Voronkova A.S., Litvinova N.A. The role of individual features of mitochondrial DNA in the pathogenesis of Parkinson’s disease. Genetics. 2020;56(4):392–400. (In Russ.) doi: 10.31857/S0016675820040141
  11. Новосадова Е.В., Арсеньева Е.Л., Мануилова Е.С. и др. Исследование нейропротекторных свойств эндоканнабиноидов N-арахидоноил- дофамина и N-докозагексаеноилдофамина на нейрональных предшественниках человека, полученных из индуцированных плюрипотентных ство- ловых клеток человека. Биохимия. 2017;82(11):1732–1739. Novosadova E.V., Arsenyeva E.L., Manuilova E.S. et al. Neuroprotective properties of endocannabinoids N-arachidonoyl dopamine and N-docosahexaenoyl dopamine examined in neuronal precursors derived from human pluripotent stem cells. Biochemistry. 2017; 82: 1367–1372. (In Russ.) doi: 10.1134/S0006297917110141
  12. Novosadova E.V., Nenasheva V.V., Makarova I.V. et al. Parkinson's disease-associated changes in the expression of neurotrophic factors and their receptors upon neuronal differentiation of human induced pluripotent stem cells. J. Mol. Neurosci. 2020;70(4):514–521. doi: 10.1007/s12031-019-01450-5
  13. Abeti R., Abramov A.Y. Mitochondrial Ca2+ in neurodegenerative disorders. Pharmacol. Res. 2015;99:377–381. doi: 10.1016/j.phrs.2015.05.007
  14. Rothbauer U., Hofmann S., Mühlenbein N. et al. Role of the deafness dystonia peptide 1 (DDP1) in import of human Tim23 into the inner membrane of mitochondria. J. Biol. Chem. 2001;276(40):37327–37334. doi: 10.1074/jbc.M105313200
  15. Dolgacheva L., Fedotova E.I., Abramov A. et al. Alpha-synuclein and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biological Membranes: Journal of Membrane and Cell Biology. 2017;34:4–14. doi: 10.1134/S1990747818010038
  16. Fernandez-Vizarra E., Zeviani M. Mitochondrial disorders of the OXPHOS system. FEBS Lett. 2021;595:1062–1106. doi: 10.1002/1873-3468.13995
  17. Kwong J.Q., Beal M.F., Manfredi G. The role of mitochondria in inherited neurodegenerative diseases. J. Neurochem. 2006;97(6):1659–1675. doi: 10.1111/j.1471-4159.2006.03990.x
  18. Allen S.P., Seehra R.S., Heath P.R. et al. Transcriptomic analysis of human astrocytes in vitro reveals hypoxia-induced mitochondrial dysfunction, modulation of metabolism, and dysregulation of the immune response. Int. J. Mol. Sci. 2020;21:8028. doi: 10.3390/ijms21218028
  19. Zhang Z., Yan J., Chang Y. et al. Hypoxia inducible factor-1 as a target for neurodegenerative diseases. Curr. Med. Chem. 2011;18(28):4335–4343. doi: 10.2174/092986711797200426
  20. de Brito O.M., Scorrano L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 2008;456(7222):605–610. doi: 10.1038/nature07534
  21. Olichon A., Baricault L., Gas N. et al. Loss of OPA1 perturbates the mitochondrial inner membrane structure and integrity, leading to cytochrome c release and apoptosis. J. Biol. Chem. 2003;278(10):7743–7746. doi: 10.1074/jbc.C200677200
  22. Baker N., Patel J., Khacho M. Linking mitochondrial dynamics, cristae remodeling and supercomplex formation: how mitochondrial structure can regulate bioenergetics. Mitochondrion. 2019;49:259–268. doi: 10.1016/j.mito.2019.06.003
  23. Kim D., Hwang H.Y., Ji E.S. et al. Activation of mitochondrial TUFM ameliorates metabolic dysregulation through coordinating autophagy induction. Commun. Biol. 2021;4(1):1–17. doi: 10.1038/s42003-020-01566-0.
  24. Murata D., Arai K., Iijima M., Sesaki H. Mitochondrial division, fusion and degradation. J. Biochem. 2020;167(3):233–241. doi: 10.1093/jb/mvz106

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Снижение экспрессии ряда генов, ассоциированных с функционированием митохондрий, в нейронах пациентов с генетическим формами БП.

Скачать (25KB)
Метаданные

© Ветчинова А.С., Капкаева М.Р., Муджири Н.М., Иллариошкин С.Н., 2023

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77-83204 от 12.05.2022.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах