Хроническое внутрижелудочковое введение уабаина вызывает моторные нарушения у мышей линии C57Bl/6

Полный текст

Введение

Кардиотонические стероиды (КТС), также называемые сердечными гликозидами, — группа соединений, синтезируемых рядом растений и животных. При попадании в организм КТС связываются с насосной α-субъединицей Na⁺,K⁺-АТФазы, обратимо ингибируя её активность. В ингибированном состоянии Na⁺,K⁺-АТФаза прекращает поддерживать и, в случае нейронов, восстанавливать электрохимический градиент на плазматической мембране. Специфический сайт связывания КТС был обнаружен между трансмембранными доменами М1–М2, М5–М6 и М7–М8 α3-субъединицы, на внеклеточной стороне белка. При связывании КТС комплекс Na⁺,K⁺-АТФазы стабилизируется в конформации E2, и его насосная активность обратимо ингибируется [1]. Несмотря на то, что в высоких концентрациях КТС ингибируют Na⁺,K⁺-АТФазу [2], наномолярные концентрации КТС, напротив, способны приводить к повышению её активности [3]. Данный эффект объясняется наличием на плазматической мембране клетки тетрамерных комплексов неактивных гетеротетрамеров Na⁺,K⁺-АТФазы, которые распадаются при связывании одного из ферментов КТС. Распад тетрамерных комплексов гетеротетрамеров Na⁺,K⁺-АТФазы приводит к увеличению количества активного фермента [4]. У лабораторных грызунов к КТС нечувствительна α1-изоформа Na⁺,K⁺-АТФазы, которая присутствует во всех клетках, что делает грызунов удобными для изучения влияния КТС конкретно на центральную нервную систему (ЦНС) [5]. Помимо α1-изоформы Na⁺,K⁺-АТФазы, в ЦНС также присутствуют α2-изоформа в астроцитах и α3-изоформа, специфичная для нейронов [6].

На клеточных культурах нейронов крыс показано, что концентрации КТС, оказывающие ингибирующее воздействие на α3-изоформу Na⁺,K⁺-АТФазы, обладают нейротоксическим эффектом [7], а концентрации, не снижающие активность Na⁺,K⁺-АТФазы, обладают нейропротекторной активностью [8, 9]. Несмотря на свою токсичность в высоких концентрациях, КТС применяются в фармакологии. Например, КТС дигоксин, продуцируемый наперстянкой (Digitalis lanata), используется при лечении сердечной недостаточности [10]. Более того, ряд исследований свидетельствует о наличии у млекопитающих эндогенных аналогов КТС [11]. Однако было обнаружено, что применение низких концентраций дигоксина вызывает у пациентов перепады настроения [12] и в некоторых случаях — состояние бреда [13]. Данное открытие привело к разработке ряда моделей биполярного расстройства, основанных на внутрижелудочковом (ICV) введении уабаина крысам и мышам [14–16].

КТС уабаин (строфантин-Г), как и дигоксин, является гликозилированным карденолидом и применяется в качестве лекарственного препарата для лечения сердечной недостаточности. В 2019 г. была описана модель уабаин-индуцированного биполярного расстройства на мышах, где было продемонстрировано, что однократное ICV-введение уабаина вызывает мание-подобное поведение, повышенный синтез дофамина и сниженную скорость обратного захвата дофамина из синаптической щели [16]. Таким образом, было подтверждено, что эффекты, наблюдаемые после введения уабаина, опосредованы в том числе изменением работы дофаминергической системы. Также было воспроизведено ранее показанное на крысах изменение активации киназы Akt, а также MAPK-киназы ERK1/2, которые связаны с активацией Д2-рецептора к дофамину.

У пациентов с болезнью Паркинсона (БП) наблюдается повышенная концентрация дигоксина в крови [17], что свидетельствует о вероятном участии эндогенных аналогов КТС в патогенезе БП. Кроме того, КТС нериифолин используют для моделирования паркинсонизма на Danio rerio [18]. Несмотря на то, что механизмы участия эндогенных КТС в патогенезе БП не изучены, их участие в развитии биполярного расстройства и депрессии показано в ряде исследований [19].

Нейротоксичность КТС связывают с развитием окислительного стресса и запуском апоптоза, опосредованного гиперактивацией киназы ERK 1/2 [20]. Стоит подчеркнуть, что аналогичный механизм наблюдается при моделировании паркинсонизма при помощи 6-гидроксидофамина. На основании приведённых данных можно предположить, что хроническое воздействие КТС посредством их косвенного воздействия на работу DAT способно влиять на функционирование и жизнеспособность дофаминергических нейронов. Предположительно, одним из механизмов, приводящих к развитию дегенеративных процессов в дофаминергических нейронах является хроническое нарушение рециркуляции дофамина [21]. Ряд исследований указывает на то, что такие нейропсихиатрические расстройства как биполярное расстройство, синдром дефицита внимания и гиперактивности, а также депрессия являются факторами риска развития БП — в патогенезе всех перечисленных расстройств ключевую роль играет нарушение работы дофаминовых рецепторов и обратного захвата дофамина [22–25]. Дисбаланс активности данных транспортёров, с преобладанием активности мембранных DA-транспортёров (DAT), приводит к накоплению токсичных продуктов метаболизма дофамина в цитоплазме, вызывая развитие окислительного стресса [26–28]. Однако дисфункция DAT также является пагубной для функции нейронов. При частичной потере функции DAT может развиваться биполярное расстройство, в то время как полная дисфункция DAT приводит к развитию ювенильного паркинсонизма [29]. Некоторые исследователи даже предлагают использовать показатель уровня активности DAT в обонятельных луковицах человека в качестве прогностического фактора риска развития БП [30]. Из данных литературы можно сделать вывод о том, что нарушение активности DAT как в сторону понижения, так и в сторону повышения способно приводить к развитию ряда патологических процессов, и, возможно, играет значимую роль в патогенезе БП. Непродолжительное ингибирующее воздействие на DAT не оказывает достоверного эффекта на риск развития БП, и функция дофаминергической системы достаточно быстро восстанавливается [31, 32]. Таким образом, факторы, вызывающие развитие долговременного нарушения функции DAT и, как следствие, дофаминергической системы в целом, необходимо искать за пределами её непосредственных элементов. Воздействие данных факторов должно приходиться на связующие звенья, нарушение функции которых наблюдается при воздействии факторов, вызывающих гибель дофаминергических нейронов. Одним из таких звеньев может быть Na⁺,K⁺-АТФаза.

Изучение нарушений, вызванных хроническим воздействием КТС в низких концентрациях на дофаминергическую систему, позволит выявить новые механизмы нарушения и регуляции её работы, а также приблизит нас к пониманию роли эндогенных КТС в ЦНС.

Целью данного исследования стало изучение влияния хронического введения КТС уабаина в латеральный желудочек мозга мышей линии C57Bl/6 на моторные функции животных, активность дофаминзависимых сигнальных каскадов и соотношения белков-регуляторов апоптоза семейства Bcl-2 в стриатуме животных, а также влияние однократного введения используемой дозы уабаина на активность Na⁺,K⁺-АТФазы в отделах головного мозга животных.

Материалы и методы

Экспериментальные животные

Эксперименты проводили на 4–6-месячных самцах мышей линии C57Bl/6 (n = 40) из вивария Санкт-Петербургского государственного университета, содержавшихся в индивидуальных вентилируемых клетках при 22 ± 1ºС, относительной влажности воздуха 50–70% и 12-часовом цикле свет : темнота (свет с 8 утра до 8 вечера), пище и воде ad libitum. Мышей содержали в соответствии с правилами использования лабораторных животных в научных исследованиях (согласно рекомендациям Федерации европейских ассоциаций по науке о лабораторных животных и Ассоциации специалистов по лабораторным животным).

Порядок проведения экспериментов утверждён этическим комитетом по экспериментам на животных СПбГУ (протокол № 131-03-1 от 25.03.2019).

Введение веществ

Животных анестезировали газовым наркозом изофлуран («IsoFlo»). После тщательного очищения черепа от поверхностных тканей им унилатерально устанавливали направляющую канюлю, изготовленную из игл 26g («KDF») с закреплённым пластиковым держателем размером 1 × 2 мм [33], при помощи стереотаксической установки по координатам: AP = –0,5; L = 1,0; на глубину 2,0 мм таким образом, что кончик канюли находился над латеральным желудочком, но не проникал внутрь, и фиксировали при помощи пломбировочного материала на основе акрилоксида. После закрепления в направляющую канюлю вставляли закрывающую канюлю, изготовленную из 33g игл («Mesoram»), длиной 3,9–4,0 мм для предотвращения закупоривания направляющих после операции. Эксперименты начинали через 3 дня после постановки канюли.

ICV-введение осуществляли посредством инъекционной канюли, изготовленной из 33g игл, соединенных инъекционной системой с Гамильтоновым шприцом, установленной на глубину 2,5 мм в направляющую канюлю. Равномерность введения обеспечивали шприцевой помпой, подающей растворы со скоростью 0,75 мкл/мин. Животным вводили 1,5 мкл уабаина, растворённого в искусственной цереброспинальной жидкости (125 мМ NaCl, 26 мМ NaHCO3, 4 мМ KCl, 1,25 мМ NaH2PO4, 2 мМ CaCl2, 2 мМ MgCl2, 25 мМ глюкозы). Контрольным животным вводили 1,5 мкл искусственной цереброспинальной жидкости.

Поведенческое тестирование

В тесте «открытое поле» оценивали локомоторную активность и стереотипное поведение. Животное помещали в центр арены размерами 40 × 40 × 40 см, подключённой к системе видеослежения («EthoVision XT», «Noldus»), и фиксировали пройденное расстояние в течение 20 мин. В программном пакете «EthoVision» изображение квадратного поля визуально разделяли на зоны: 4 угла, 4 края и центральную. Центральная зона представляла собой квадрат, расположенный по центру поля с диагональю, равной 1/2 диагонали всего поля. Двигательную стереотипию животных в «открытом поле» оценивали с использованием алгоритма анализа программы «EthoVision XT». Данный алгоритм рассчитывает индекс спонтанных чередований следующим способом: количество чередований (Аlt) соответствует количеству отрезков траектории, где животное последовательно проходило соседние зоны «открытого поля» (за исключением центральной); максимально возможное число чередований (mАlt) рассчитывается как разность между общим числом зон, в которые животные заходили нерегулярно, и количества выбранных для анализа зон без одной зоны; индекс чередований (индекс стереотипии, IAlt) рассчитывается как процентное отношение количества чередований к максимально возможному числу чередований:

I_Alt = Alt/mАlt × 100%.

В тесте «удержание на планке» определяли координацию движений животных. Мышей помещали всеми четырьмя конечностями в начале гладкого деревянного стержня с круглым сечением (диаметр — 10 мм, длина 100 см), приподнятого на 80 см от поверхности пола, ориентируя тело животного вдоль стержня. На противоположном конце стержня располагали плоскую прямоугольную платформу размером 15 × 15 см. Перед проведением эксперимента животных обучали хождению вдоль стержня. Во время эксперимента фиксировали время прохождения от начала стержня до платформы, количество соскальзываний лап (ошибок) и падений при выполнении теста.

В тесте «лестница с перекладинами» оценивали мелкую моторику конечностей и координацию движений животных. Мышей помещали в начало лестницы, состоящей из металлических прутьев диаметром 2 мм, расположенных на расстоянии 1,5 см друг от друга, и наклонённой под углом 15°. В начале лестницы располагали домашнюю клетку. Перед проведением эксперимента животных обучали хождению по лестнице. Во время эксперимента фиксировали время прохождения теста и количество соскальзываний лап с перекладин лесенки (ошибки).

Сбор материала

Животных эвтаназировали при помощи дислокации шейных позвонков. Мозг извлекали на льду с последующим разделением на отделы (стриатум, ствол мозга, мозжечок, гиппокамп) и замораживали в жидком азоте. Материал хранили при –80ºC.

Определение активности Na⁺,K⁺-АТФазы

Активность Na⁺,K⁺-АТФазы определяли по методу накопления неорганического фосфата. Все операции проводили на льду. Взвешенную ткань гомогенизировали в десятикратном объёме буфера для выделения (0,25 М сахароза, 1 мМ ЭДТА, 20 мМ Трис, pH 7,45), содержащего коктейли ингибиторов протеаз и фосфатаз (1 : 1000, «Sigma»), добавленных непосредственно перед использованием, с помощью гомогенизатора «Schuett Homgenplus» («SchuettBiotec GmbH»). Гомогенат центрифугировали в течение 2 мин при 4ºС и 1000g. Супернатант переносили в отдельную пробирку и повторно центрифугировали в течение 15 мин при 4ºС и 10 000g. Синаптосомальную фракцию ресуспендировали в буфере для выделения и хранили при –80ºС. Для определения концентрации белка часть препарата лизировали с помощью RIPA-буфера («Sigma»), содержащего коктейли ингибиторов протеаз и фосфатаз, и определяли концентрацию белка с помощью набора «DC Protein Assay Kit» («Bio-Rad»). Синаптосомальную фракцию с концентра-цией белка 2 мкг/мкл инкубировали в присутствии 0,065% дезоксихолата натрия на холодной водяной бане в течение 30 мин. Полученный препарат Na,K-АТФазы в конечной концентрации 0,05 мкг/мкл добавляли в реакционную среду (130 мМ NaCl, 20 мМ KCl, 3 мМ MgCl2, 30 мМ имидазол, pH 7,5). Для измерения активности других АТФ-зависимых ферментов использовали насыщенный раствор уабаина в реакционном буфере. Реакцию запускали добавлением 3 мМ АТФ и инкубировали реакционную смесь в течение 15 мин при 37ºС. Реакцию останавливали добавлением 0,1 мл охлаждённого 3 М ацетатного буфера pH 4,3, содержащего 3,7% формальдегида. Для определения количества высвободившегося неорганического фосфата к образцу добавляли 0,02 мл 2% гептамолибдата аммония и 0,02 мл свежеприготовленного 0,3% раствора хлорида олова (II). Образцы тщательно перемешивали и инкубировали в течение 10 мин. Оптическую плотность раствора измеряли при 735 нм с помощью планшетного ридера «Synergy H1» («BioTek»). Активность Na, K-АТФазы рассчитывали по разнице между оптической плотностью в тестовом образце и образце, содержащем насыщенный раствор уабаина.

Иммуноблоттинг

Образцы тканей лизировали в RIPA-буфере («Sigma») с добавлением ингибиторов протеаз и фосфатаз (1 : 1000, «Sigma»). Полученный лизат центрифугировали при 14 000g в течение 20 мин при 4ºС, затем отбирали супернатант, в котором измеряли концентрацию белка с помощью набора реактивов «DC Protein Assay Kit» («Bio-Rad»). Разделение белков осуществляли электрофорезом в полиакриламидном геле по Леммли, после чего белки переносили на PVDF-мембрану («Whatman») и инкубировали с антителами согласно рекомендациям производителей. Для анализа использовали первичные антитела к p-Akt (Ser473), Akt, p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204), ERK1/2, Bak, Bax, Bcl-2, Bcl-xL («Cell Signaling Technology»), pJNK (Thr183/Tyr185), JNK, NR2B, GAPDH и β-актину («Santa Cruz Biotechnology»), NKA α1 a6F («DSHB»), NKA α3 («Thermo Scientific») и вторичные антикроличьи и антимышиные антитела («Cell Signaling Technology»), конъюгированные с пероксидазой хрена. Мембраны проявляли при помощи хемилюминесцентного субстрата «SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate» («Thermo Scientific»), люминесценцию детектировали при помощи системы гель-документирования «ChemiDoc MP» («Bio-Rad»), интенсивность люминесценции рассчитывали с помощью программы «Image Lab 6.0.1» («Bio-Rad»). Активацию киназ оценивали по отношению интенсивности полос фосфорилированной формы киназы к интенсивности полос её общей формы (уровень фосфорилирования).

Статистический анализ

Статистическую обработку результатов осуществляли при помощи пакета статистических программ «GraphPad Prism 7». Данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартная ошибка среднего (mean ± SEM). Анализ результатов экспериментов проводили с использованием t-теста и одностороннего (one-way ANOVA) или двустороннего анализа дисперсии (two-way ANOVA) с тестом множественного сравнения Тьюки с предварительной проверкой на нормальность по критерию Шапиро–Уилка. Достоверность отличий во всех опытах принимали при p < 0,05.

Результаты

Моторные нарушения и локомоторная активность мышей после введения уабаина

Исследование влияния ICV-введения 1,5 мкл 50 мкМ (75 пмоль, 43,8 нг) уабаина в латеральный желудочек мозга на неврологический статус и локомоторную активность животных проведено через 24 ч после 4-дневного введения уабаина. Для оценки неврологического статуса животных использовали тесты «удержание на планке» и «лесенка с перекладинами».

Через 24 ч после 4-дневного ICV-введения уабаина животные, которым вводили уабаин, проходили тест «лесенка с перекладинами» в 1,6 раза медленнее (p = 0,045), чем животные из контрольной группы, и делали в 3 раз больше ошибок (p < 0,028; рис. 1, А). Тест «удержание на планке» на 5-й день животные, которым вводили уабаин, проходили в 2 раза медленнее (p < 0,031), чем животные из контрольной группы, и делали в 3,6 раза больше ошибок (p < 0,02). Из представленных результатов можно предположить, что многократное введение уабаина мышам линии C57Bl/6 приводит к нарушению способности животных удерживать равновесие, а также производить точные движения конечностями.

 

Рис. 1. Влияние 4-дневного ICV-введения уабаина в латеральный желудочек мозга мышей линии C57Bl/6 (n = 5) на время прохождения расстояния (А), количество ошибок в тесте «лесенка с перекладинами» (В), расстояние (С), количество ошибок в тесте «удержание на планке» (D).

Данные представлены в виде mean ± SEM; *p < 0,05.

Fig. 1. The effect of 4-day ICV ouabain administration to C57Bl/6 mice (n = 5) on the traversal time (А), the number of errors in ladder rung walking test (В), distance (C), the number of errors in the beam balance test (D).

The data are presented as mean ± SEM; *p < 0.05.

 

Для оценки локомоторной активности животных через 24 ч после 4-дневного введения уабаина был проведён 20-минутный тест «открытое поле» и определена двигательная активность животных, выраженная в средней скорости передвижения. Для оценки стереотипичности передвижений животных также был рассчитан IAlt.

Через 24 ч после 4-дневного ICV-введения уабаина двигательная активность животных, выраженная в средней скорости передвижения, увеличивалась в 1,9 раза (p = 0,029) по сравнению с контрольной группой (рис. 2, А). IAlt животных в тесте «открытое поле» через 24 ч после 4-дневного введения уабаина был в 7 раз выше, чем у животных контрольной группы (p = 0,036; рис. 2, В), что говорит о выраженной стереотипичности передвижений у группы животных, которым вводили уабаин. Из представленных данных можно сделать вывод о том, что при многократных введениях уабаина увеличение двигательной активности и стереотипность передвижений животных сохраняется через 1 сут после последнего введения, а также что у животных развивается нарушение координации движений.

 

Рис. 2. Влияние 4-дневного ICV-введения уабаина в латеральный желудочек мозга мышей линии C57Bl/6 (n = 5) на двигательную активность (А) и IAlt (В) в 20-минутном тесте «открытое поле».

Данные представлены в виде mean ± SEM; *p < 0,05.

Fig. 2. The effect of 4-day ICV ouabain administration to C57Bl/6 mice (n = 5) on motor activity (A) and IAlt (B) values acquired from the 20-minute open field test.

The data are presented as mean ± SEM; *p < 0.05.

 

Влияние уабаина на каталитическую активность Na⁺,K⁺-АТФазы в мозге мышей

Для того, чтобы оценивать влияние уабаина в ЦНС мышей линии C57Bl/6, необходимо выяснить, как используемая при ICV-введении доза уабаина влияет на ферментативную активность Na⁺,K⁺-АТФазы разных отделов мозга животных. Активность Na⁺,K⁺-АТФазы была измерена в грубой синаптосомальной фракции стриатума, гиппокампа, ствола и мозжечка животных из контрольной группы и через 10, 30 мин после введения уабаина.

Через 10 мин после введения уабаина активность Na⁺,K⁺-АТФазы синаптосомальной фракции стриатума животных увеличилась в 1,4 раза (p < 0,05), а через 30 мин достоверно не отличалась от активности фермента в контрольной группе (рис. 3, А). Устойчивая к ингибированию 5 мМ уабаином активность составила 4,1 мкМ Pi/мг белка/мин.

Активность Na⁺,K⁺-АТФазы синаптосомальной фракции гиппокампа животных через 10 и 30 мин после введения уабаина достоверно не отличалась от активности фермента в контрольной группе (рис. 3, В). Устойчивая к ингибированию 5 мМ уабаином активность составила 4,4 мкМ Pi/мг белка/мин.

В синаптосомальной фракции ствола мозга животных через 10 мин после введения уабаина активность Na⁺,K⁺-АТФазы достоверно не отличалась от активности фермента в контрольной группе, а через 30 мин после введения уабаина уменьшилась в 1,8 раза (рис. 3, С; p < 0,05). Устойчивая к ингибированию 5 мМ уабаином активность составила 5 мкМ Pi/мг белка/мин.

 

Рис. 3. Влияние 50 мкМ уабаина на активность Na⁺,K⁺-АТФазы синаптосомальной фракции стриатума (А), гиппокампа (В), ствола (С), мозжечка (D) мышей линии C57Bl/6 (n = 5) через 10 и 30 мин после ICV-введения 1,5 мкл в латеральный желудочек мозга.

Данные представлены в виде mean ± SEM; *p < 0,05.

Fig. 3. The ouabain effects on Na⁺/K⁺-ATPase activity in the synaptosomal fraction derived from the striatum (А), hippocampus (В), brainstem (С), and cerebellum (D) in C57Bl/6 mice (n = 5) at 10 and 30 minutes after the ICV injection into a lateral cerebral ventricle.

The data are presented as mean ± SEM; *p < 0.05.

 

Исходя из полученных данных можно сказать, что ICV-введение 1,5 мкл 50 мкМ уабаина в латеральный желудочек мозга через 10 мин после введения приводит к непродолжительному увеличению активности Na⁺,K⁺-АТФазы в стриатуме и уменьшению активности фермента в стволе мозга животных через 30 мин после введения.

Влияние уабаина на активацию внутриклеточных сигнальных киназ и количество белков в стриатуме мышей

Ранее было показано, что однократное ICV-введение 50 мкМ уабаина вызывает активацию Akt и ERK1/2 [16]. На первичной культуре нейронов больших полушарий также установлено, что продолжительное воздействие уабаина (6–18 ч) вызывает инактивацию другой MAP-киназы — JNK [7]. Для того чтобы выяснить, как многократное ICV-введение 50 мкМ уабаина влияет на активацию внутриклеточных сигнальных каскадов, связанных с дофаминовыми рецепторами и ранее исследованными эффектами уабаина, проанализирована активация киназ Akt, ERK1/2 и JNK в стриатуме животных после 4-кратного ежедневного введения 50 мкМ уабаина (на 5-е сутки через 24 ч после последнего введения). Анализ активации киназ проводили, сравнивая соотношение фосфорилированной формы киназы к количеству её общей формы у контрольных и получавших уабаин животных при помощи иммуноблоттинга.

Четырёхкратное ежедневное введение 50 мкМ уабаина вызывает уменьшение активации Akt на 62,2% (p < 0,05) в стриатуме животных через 24 ч после последнего введения по сравнению с контролем (рис. 4, А). В то же время активация ERK1/2 и JNK по сравнению с контролем не изменялась (рис. 4, В, С). Из полученных данных можно заключить, что долговременные эффекты уабаина не включают изменения активации MAP-киназ ERK1/2 и JNK. При этом можно предположить, что происходит переключение внутриклеточных сигнальных каскадов на «медленный» ответ на активацию дофаминовых рецепторов, который приводит к инактивации киназы Akt [34].

 

Рис. 4. Влияние 4-кратного ежедневного введения 50 мкМ уабаина на активацию Akt (А), ERK1/2 (В) и JNK (С) в стриатуме мышей линии C57Bl/6 через 24 ч после последнего введения.

Данные представлены в виде mean ± SEM; *p < 0,05. Под графиками приведены репрезентативные изображения иммунореактивных полос.

Fig. 4. The effects of once daily 4-day administration of 50 µM ouabain on Akt (А), ERK1/2 (В), and JNK (С) activationin the C57Bl/6 mice striatum measured 24 hours after the last injection.

The data are presented as mean ± SEM; *p < 0.05. Under the charts representative immunoreactive bands are presented.

 

На первичной культуре нейронов крысы было показано, что уабаин может вызывать уменьшение количества NR2B-субъединицы NMDA-рецептора [35]. Сделано предположение о том, что многократное введение уабаина может приводить к изменению количества Na⁺,K⁺-АТФазы, а также взаимодействующего с ней NMDA-рецептора. Для проверки данного предположения была проведена оценка влияния ICV-введения уабаина на количество α1- и α3-изоформ α-субъединицы Na⁺,K⁺-АТФазы и количество NR2B-субъединицы NMDA-рецептора в стриатуме мышей.

Многократное введение уабаина не вызвало изменения количества α1- и α3-изоформ α-субъединицы Na⁺,K⁺-АТФазы (рис. 5, А, В). Количество NR2B-субъединицы NMDA-рецептора в стриатуме животных через 24 ч после последнего введения уменьшилось на 37,4% (p < 0,05) у животных, которым вводили уабаин, по сравнению с контролем (рис. 5, С).

 

Рис. 5. Влияние 4-кратного ежедневного введения 50 мкМ уабаина на количество α1- (А) и α3- (B) изоформ α-субъединицы Na⁺,K⁺-АТФазы, а также количество NR2B-субъединицы NMDA-рецептора (C) в стриатуме мышей линии C57Bl/6 через 24 ч после последнего введения.

Данные представлены в виде mean ± SEM; *p < 0,05. Под графиками приведены репрезентативные изображения иммунореактивных полос.

Fig. 5. The effect of once daily 4-day administration of 50 µM ouabain on the levels of α1 (А) and α3 (B) isoforms in α subunit of Na⁺/K⁺-ATPase and the levels of NR2B subunits in NMDA-receptors (C) in the mice's striatum measured 24 hours after the last injection.

The data are presented as mean ± SEM; *p < 0.05. Under the charts representative immunoreactive bands are presented.

 

Хотя, согласно ранее полученным данным, однократное ICV-введение 50 мкМ уабаина не вызывает гибели нейронов [16], было сделано предположение, что многократное воздействие 50 мкМ уабаина может вызывать нарушение гомеостаза белков — регуляторов митохондриального пути апоптоза. Для того чтобы проверить данное предположение, было исследовано влияние 4-кратного ежедневного ICV-введения 50 мкМ уабаина на количество проапоптотических и антиапоптотических белков семейства Bcl-2 в стриатуме животных через 24 ч после последнего введения.

Как видно из рис. 6, 4-кратное ежедневное введение 50 мкМ уабаина не вызывает изменения количества Bak, Bax, Bcl-2, Bcl-xL в стриатуме животных через 24 ч после последнего введения по сравнению с контролем. Исходя из этого можно заключить, что либо в данном дизайне эксперимента уабаин не оказывает нейротоксического действия в стриатуме животных, либо нейротоксичность уабаина не связана с изменением основных белков-регуляторов митохондриального пути апоптоза семейства Bcl-2.

 

Рис. 6. Влияние четырехкратного ежедневного введения 50 мкМ уабаина на количество Bak (А), Bax (В), Bcl-2 (С), Bcl-xL (D) в стриатуме мышей линии C57Bl/6 через 24 ч после последнего введения.

Данные представлены в виде mean ± SEM; *p < 0,05. Под графиками приведены репрезентативные изображения иммунореактивных полос.

Fig. 6. The effects of once-daily 4-day administration of 50 µM ouabain on the levels of Bak (А), Bax (В), Bcl-2 (С), Bcl-xL (D) proteins in the C57Bl/6 mouse striatum measured 24 hours after the last injection.

The data are presented as mean ± SEM; *p < 0.05. Under the charts representative immunoreactive bands are presented.

 

Обсуждение

Для оценки равновесия и координации движений животных использовали два теста: «удержание на планке» и «лесенка с перекладинами». В обоих тестах животные, получавшие уабаин, совершили значительно большее количество ошибок, чем контрольные животные, и затратили большее количество времени на прохождение тестов. Наблюдаемые различия можно объяснить тем, что хроническое введение уабаина может вызывать нарушение способности держать равновесие и совершать точные движения. Данные тесты используются для оценки широкого спектра моторных нарушений, в том числе в моделях паркинсонизма [36, 37]. Ранее было показано, что однократное введение уабаина грызунам вызывает мание-подобное поведение [16]. Однако подобные нарушения не наблюдаются в моделях мании на животных [38], что свидетельствует о возникновении функциональных либо органических нарушений дофаминергической системы в ответ на многократное введение нетоксической дозы уабаина.

Поскольку однократное введение уабаина вызывало увеличение двигательной активности и стереотипичности передвижений животных, опосредованных активаций Д2-зависимых внутриклеточных сигнальных каскадов [16], было проведено исследование воздействия 4-дневного ICV-введения уабаина на моторику и двигательную активность животных, а также активацию дофаминзависимых внутриклеточных сигнальных каскадов. Через 1 сут после 4-го введения уабаина двигательная активность, а также стереотипичность передвижений животных, получавших уабаин, в «открытом поле» была выше, чем соответствующие показатели животных контрольной группы, чего не наблюдалось при однократном введении [16].

Существует ряд исследований, свидетельствующих о том, что в низких концентрациях КТС способны приводить к повышению активности Na⁺,K⁺-АТФазы [3, 4]. Было показано, что Na⁺,K⁺-АТФаза присутствует на мембране в тетрамерных комплексах, и при связывании уабаина с одним из ферментов данные комплексы распадаются [4]. Распад комплекса приводит к высвобождению ферментов и их активации, таким образом увеличивая общую наблюдаемую активность Na⁺,K⁺-АТФазы в клетке. Наблюдаемое повышение активности Na⁺,K⁺-АТФазы в стриатуме через 10 мин после ICV-введения уабаина свидетельствует о том, что до стриатума доходят низкие концентрации уабаина, которые способны вызывать изменения в сигнальной функции Na⁺,K⁺-АТФазы, однако при этом не вызывают снижения её активности. Наблюдаемое увеличение активности может также быть опосредовано другими механизмами, в том числе встраиванием в мембрану депонированного белка. Напротив, наблюдаемое снижение активности в стволе мозга через 30 мин после введения косвенно указывает на высокие концентрации уабаина в данной структуре. Однако без масс-спектрометрического определения количества КТС непосредственно в образцах мозга невозможно сделать вывод о том, какие концентрации КТС доходят до тех или иных структур. Можно предположить, что для достижения тех же эффектов в мозге человека потребовались бы значительно меньшие концентрации КТС, чем в данном эксперименте, поскольку как α1-, так и α2-, α3-изоформы Na⁺,K⁺-АТФазы у человека на 1–2 порядка (по данным разных исследований) более чувствительны к уабаину, чем у мыши [39, 40].

На основе повышения активности Na⁺,K⁺-АТФазы в стриатуме можно сделать предположение о том, что при ICV-введении в стриатуме уабаин находится в низких концентрациях и влияет на сигнальную функцию Na⁺,K⁺-АТФазы. Известно, что мание-подобное поведение, наблюдаемое у мышей после однократного введения уабаина, сопровождается активацией киназ ERK 1/2 и Akt [16], а также что запуск данных каскадов осуществляется через активацию Д2-дофаминовых рецепторов. Можно предположить, что снижение активации Akt с последующей активацией киназы GSK3β происходит вследствие активации более медленного β-аррестинового пути [34].

Высокие концентрации КТС способны вызывать неспецифичную гибель клеток путём активации сигнальных каскадов, приводящих к апоптозу [41]. Для исключения данного процесса были оценены уровни содержания как антиапоптотических (Bcl-2, Bcl-xL), так и проапоптотических (Bak, Bax) белков в стриатуме экспериментальных животных. Отсутствие достоверных изменений в количестве белка свидетельствует о том, что концентрации КТС, используемые в данной работе, не вызывали запуска неспецифичного митохондриального пути апоптоза.

Снижение количества NR2B-субъединицы NMDA-рецеп-тора в стриатуме после 4-дневного введения 50 мкМ уабаина мышам согласуется с ранее полученными данными на первичной культуре клеток мозжечка крысы [35]. Данный эффект может объяснять полученные ранее другими исследователями данные об ухудшении пространственной памяти у крыс при ICV-введении уабаина [15], поскольку NR2B-субъединица важна для процессов формирования памяти [42, 43]. Отсутствие влияния введения уабаина на количество α1- и α3-изоформ Na⁺,K⁺-АТФазы свидетельствует о том, что долговременные физиологические эффекты введения уабаина не связаны с изменением общего количества Na⁺,K⁺-АТФазы.

Заключение

Четырёхдневное ICV-введение 50 мкМ уабаина мышам линии C57Bl/6 вызывает гиперлокомоцию, сохраняющуюся на 5-й день эксперимента и сопровождающуюся нарушением координации движений. Наблюдаемые изменения в поведении обусловлены изменениями в дофаминергической передаче, предположительно с запуском медленного β-аррестинового пути, и снижением активности Na⁺,K⁺-АТФазы в стволе мозга. В стриатуме, напротив, наблюдается повышение её активности.

Представленные в данном исследовании результаты показывают, что хроническое воздействие КТС на Na⁺,K⁺-АТФазу ЦНС приводит к функциональным нарушениям работы дофаминергической системы, а также открывают перспективу фармакологического воздействия на функции Na⁺,K⁺-АТФазы для коррекции данных нарушений.

Этическое утверждение. Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с «Consensus Author Guidelines for Animal Use» (IAVES, 23.07.2010). Протокол исследования одобрен Этическим комитетом СПбГУ (протокол № 131-03-1 от 25.03.2019).

Источник финансирования. Исследование выполнено за счёт гранта Российского научного фонда № 22-75-10131, https://rscf.ru/project/22-75-10131/ и при поддержке гранта СПбГУ № 94030300. Работы с животными проводились на базе вивария, входящего в состав ресурсного центра СПбГУ.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Ethics approval. Authors confirm compliance with institutional and national standards for the use of laboratory animals in accordance with «Consensus Author Guidelines for Animal Use» (IAVES, 23 July 2010). The research protocol was approved by the Ethics Committee of the St. Petersburg State University (protocol No. 131-03-1, March 25, 2019).

Source of funding. The study was supported by grant No. 22-75-10131 from the Russian Science Foundation, https://rscf.ru/project/22-75-10131/, and grant No. 94030300 from Saint Petersburg State University. All research conducted on animals was performed in the vivarium of the Saint Petersburg State University Resource Center.

Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.

Author contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, draf-ting and revising the work, final approval of the version to be published.

Об авторах

Юлия Анатольевна Тимошина

ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»; ФГБНУ «Научный центр неврологии»

Email: july.timoschina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0546-8767

аспирант, кафедра высшей нервной деятельности биологического факультета ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»; м.н.с. лаб. экспериментальной и трансляционной нейрохимии Института мозга ФГБНУ «Научный центр неврологии»

Россия, Москва; Москва

Рогнеда Борисовна Казанская

ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»; ФГБНУ «Научный центр неврологии»

Email: st059046@student.spbu.ru
ORCID iD: 0000-0002-2194-6749

аспирант биологического факультета ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»; лаборант-исследователь лаборатории экспериментальной и трансляционной нейрохимии Института мозга ФГБНУ «Научный центр неврологии»

Россия, Санкт-Петербург; Москва

Владислав Андреевич Завьялов

ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»

Email: vladislavletsgo@outlook.com
ORCID iD: 0009-0000-6576-3373

аспирант, лаборант лаборатории нейробиологии и молекулярной фармакологии Института трансляционной биомедицины 

Россия, Санкт-Петербург

Анна Борисовна Вольнова

ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»

Email: a.volnova@spbu.ru
ORCID iD: 0000-0003-0724-887X

д.б.н., с.н.с. каф. общей физиологии биологического факультета 

Россия, Санкт-Петербург

Александр Васильевич Латанов

ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»

Email: latanov@neurobiology.ru
ORCID iD: 0000-0003-2729-4013

д.б.н., проф., зав. каф. высшей нервной деятельности биологического факультета 

Россия, Москва

Татьяна Николаевна Федорова

ФГБНУ «Научный центр неврологии»

Email: tnf51@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-0483-1640

д.б.н., г.н.с., зав. лаб. экспериментальной и трансляционной нейрохимии Института мозга 

Россия, Москва

Рауль Радикович Гайнетдинов

ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»

Email: gainetdinov.raul@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2951-6038

к.м.н., зав. лаб. нейробиологии и молекулярной фармакологии, научный руководитель Клиники высоких медицинских технологий им. Н.И. Пирогова, директор Института трансляционной биомедицины 

Россия, Санкт-Петербург

Александр Васильевич Лопачев

ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»; ФГБНУ «Научный центр неврологии»

Автор, ответственный за переписку.
Email: lopachev@neurology.ru
ORCID iD: 0000-0002-5688-3899

к.б.н., н.с., лаб. экспериментальной и трансляционной нейрохимии Института мозга ФГБНУ «Научный центр неврологии»; н.с. лаб. нейробиологии и молекулярной фармакологии, ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»

Россия, Санкт-Петербург; Москва

Список литературы

Дополнительные файлы