Introduction. Study of the morphofunctional neuronal development in a dissociated cerebrocortical cell culture, using modern cell technologies, is a priority in experimental neurology, which is required for successful in vitro modelling of acute and chronic forms of cerebral pathology.
Aim. A morphofunctional study of the in vitro changes in neuronal differentiation of rat cerebral cortical neurons, using a range of analysis methods, including immunohistochemistry, fluorescence, and electrophysiology.
Materials and methods. We investigated the degree of culture differentiation on day 3–4 and day 10–11 of in vitro cultivation, measured by the intensity of the PSA-NCAM protein expression and the level of neuronal glutamate-induced calcium overload. That was then compared with the functional activity of the neuronal network cultivated on a microelectrode array, and with changes of the neuronal network’s activity in response to glutamate receptor overstimulation.
Results. A significant glutamate-induced increase of the intracellular calcium concentration was typical for mature neurons (day 10–11 of cultivation), along with a lack of PSA-NCAM paranuclear accumulation, which was only found in immature cells (day 3–4 of cultivation). There was a glutamate suppression of the neuronal network burst activity, formed in vitro by day 10–11, with had no effect on the generation of single action potentials. At the same time, kainate, the exogenous selective agonist of the one of the glutamate subtypes, completely blocked spontaneous activity of the mature neurons.
Conclusion. Neocortical rat neurons reach the differentiation level necessary for the modelling of the cerebral pathologies by day 10–11 of in vitro cultivation. At this point, the process of disruption of the microelectrode array cultivated neuronal network by the glutamate receptor overactivation, has become multilayered: excitotoxic glutamate-induced damage produces selective disruption of neuronal burst activity, and with the greater cytotoxicity caused by kainate, spontaneous bioelectrical activity is completely blocked.
Исследование морфофункционального развития нейронов в диссоциированной культуре клеток головного мозга с использованием современных клеточных технологий является актуальной задачей экспериментальной неврологии, решение которой необходимо для успешного моделирования in vitro острых и хронических форм церебральной патологии.
Цель работы — морфофункциональное исследование in vitro динамики дифференцировки нейронов коры головного мозга крыс с использованием комплекса методов иммуноцитохимического, флюоресцентного и электрофизиологического анализа.
Материалы и методы. Исследована степень дифференцировки культур на 3–4-е и 10–11-е сутки культивирования in vitro, определяемая по интенсивности экспрессии белка PSA-NCAM и уровню кальциевой перегрузки нейронов под влиянием глутамата, в сопоставлении с показателями функциональной активности нейронной сети, культивированной на мультиэлектродной матрице, и их изменениями при гиперстимуляции глутаматных рецепторов.
Результаты. Для зрелых нейронов (10–11 сут культивирования) характерны значительное повышение концентрации внутриклеточного кальция, вызываемое глутаматом, отсутствие в них околоядерных скоплений PSA-NCAM, обнаруживаемых лишь в незрелых клетках (3–4 сут культивирования), торможение глутаматом пачечной активности нейронной сети, сформированной к 10–11-м суткам in vitro, при отсутствии его влияния на генерацию одиночных потенциалов действия. В то же время экзогенный селективный агонист одного из подтипов глутаматных рецепторов — каинат полностью блокировал спонтанную активность зрелых нейронов.
Заключение. К 10–11-м суткам культивирования in vitro нейроны новой коры крыс достигают уровня дифференцировки, необходимого для моделирования церебральных патологических состояний. К этому сроку процесс нарушения функционирования нейронной сети, сформированной на мультиэлектродной матрице, при гиперактивации глутаматных рецепторов носит многоуровневый характер: при эксайтотоксическом повреждении под влиянием глутамата избирательно нарушается пачечная активность нейронов, а при более выраженной цитотоксичности, вызываемой каинатом, спонтанная биоэлектрическая активность блокируется полностью.