MicroRNA as significant biomarkers of cerebrovascular atherosclerosis

Full Text

Введение

Атеросклероз сосудов головного мозга и, преимущественно, каротидный атеросклероз (КА) является одной из основных причин развития ишемического инсульта и цереброваскулярной патологии (ЦВП). Эпидемиологические данные о распространённости КА в возрастной группе 30–79 лет указывают на рост заболеваемости в 2020 г. по сравнению с 2000 г.: так, расчётная частота увеличения толщины комплекса интима–медиа — 27,6%, выявления атеросклеротической бляшки в сонных артериях — 21,1%, каротидного стеноза (сужения просвета более 50%) — 1,5% [1]. С учётом хронического характера КА, его полиэтиологической природы (включающей, помимо прочего, роль воспаления, дисфункции эндотелия, нарушения метаболизма холестерина) [2] и ассоциации с множеством факторов риска поиск возможных биомаркеров развития и прогрессирования этого состояния представляется одним из перспективных направлений профилактики ЦВП.

Ранее нами был проведён цикл работ по определению гемореологического и гемостазиологического профилей у пациентов с различными проявлениями КА, описана информативность ряда биомаркеров этого спектра, разработана и внедрена в клиническую практику панель проатерогенной направленности [3, 4].

Важными новыми биомаркерами различных патологий являются микроРНК — небольшие (около 22 нуклеотидов), состоящие из одной цепочки некодирующие последовательности РНК, которые, по всей видимости, влияют на большинство биологических процессов [5].

Обычно микроРНК подавляют экспрессию генов путём взаимодействия с 3’-нетранслируемым участком таргетной матричной РНК, вызывая её деградацию и/или блокируя трансляцию продукта гена. Важным свойством микроРНК является плейотропность их действия, т.е. одна молекула может модулировать множество матричных РНК, вовлечённых в различные билогические процессы. Верно и обратное — одна мРНК может являться «целью» несколько микроРНК [6].

В проведённом нами пилотном исследовании на небольшой когорте пациентов с проявлениями хронической ЦВП были продемонстрированы различия в экспрессии miR-126-5p, miR-126-3p, miR-29-5p, miR-29-3p, miR-33a-5p, miR-33a-3p, miR-21-5p, miR-21-3p в зависимости от наличия у них каротидного атеросклероза [7].

Цель настоящей работы — анализ паттерна экспрессии указанных микроРНК у пациентов с выраженными каротидными стенозами (70% и более) — группой, представляющей наибольший интерес в качестве «модельного» варианта КА.

Материалы и методы

В исследование были включены 50 человек (медиана возраста 66 [61; 71] лет; 58% мужчины) с ЦВП на фоне КА разной степени выраженности, подтверждённого данными ультразвукового исследования. Спектр ЦВП включал как последствия перенесённых более 6 мес назад ишемических нарушений мозгового кровообращения, так и хроническое течение сосудистой патологии головного мозга без чётких указаний на инсульт в анамнезе. Диагноз ЦВП устанавливали на основании жалоб, клинической картины и в соответствии с рутинными ангионейровизуализационными обследованиями, входящими в текущие стандарты оказания медицинской помощи.

У 16 (32%) пациентов стеноз внутренней сонной артерии (ВСА) составил 70% и более — эта когорта стала основной группой исследования. Остальные 34 пациента со стенозом ВСА <70% вошли в группу сравнения. Доля симптомных пациентов (т.е. перенёсших ипсилатеральное нарушение мозгового кровообращения) была сопоставима между группами: 5 (31%) и 8 (23,5%); p > 0,05.

К критериям исключения относились наличие декомпенсированных хронических заболеваний, опухолевых и паранеопластических процессов, патология крови.

Всем пациентам были проведены детальное клинико- неврологическое обследование, рутинные анализы крови (общий, биохимический, коагулограмма).

Основным объектом исследования стало определение экспрессии ряда микроРНК: miR-126-5p, miR-126-3p, miR-29-5p, miR-29-3p, miR-33a-5p, miR-33a-3p, miR-21-5p, miR-21-3p.

Методика выделения и определения экспрессии микроРНК

Кровь для анализа забирали при кубитальной венопункции натощак в пробирку-вакутейнер с ЭДТА К3.

Использовали следующие реагенты и оборудование: смесь валидированных 20Х праймеров и зондов для мишеней hsa-miR («Thermo Fisher Scientific»), набор для выделения микроРНК из лейкоцитов «Leukocyte RNA Purification Plus Kit» («NORGEN Biotec Сorp.»), набор для синтеза кДНК с матрицы микроРНК с использованием универсальных праймеров «TaqMan™ Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit» («Applied Biosystems™ Thermo Fisher Scientific», амплификатор «Real-time CFX96 Touch» («BioRaD»).

Исследование микроРНК включало две стадии:

1. Выделение микроРНК из лейкоцитов в следующей последовательности: лизис эритроцитов, приготовление клеточного лизата, гомогенизация лизата, связывание с колонкой для гомогенизации, два этапа промывки колонок и обработка DNase I, элюирование РНК.
2. Определение количества копий микроРНК на амплификаторе с проведением обратной транскрипции.

Этическая экспертиза

Всеми пациентами было подписано информированное согласие на участие в исследовании. Работа одобрена локальным этическим комитетом ФГБНУ НЦН (протокол № 11-4/19 от 20.11.2019).

Статистические методы

Статистическая обработка данных проводилась с использованием языка программирования R (версия 4.1.0) в программной оболочке «RStudio v.1.4.1717» и загружаемых модулей «tidyverse», «reshape2», «heatmaply», «ggstatsplot», «ggcorrplot». Непрерывные случайные величины представлены в виде: медиана [нижний квартиль; верхний квартиль], категориальные — как частота (%). Две независимые группы сравнивали с использованием критерия Вилкоксона–Манна–Уитни, пропорции в двух выборках — с помощью z-статистики Пирсона. С целью визуального представления относительного уровня экспрессии исследованных микроРНК использована «тепловая карта», где каждая строка соответствует одному наблюдению. Трансформация данных проведена с помощью функции «percentize», заключавшейся в применении эмпирической (выборочной) функции распределения к каждому значению переменных: таким образом, цвет ячейки указывает на значение перцентиля (то есть долю пациентов со значением экспрессии таким же или меньше). В использованной цветовой палитре «viridis» значения, близкие к 1, принимали жёлтый цвет, а близкие к 0 — тёмно-синий. Иерархическая кластеризация проведена с использованием алгоритма «optimal leaf ordering», визуализирована с помощью дендрограмм. Столбец «Стеноз» отражает оригинальное деление на группы, более тёмный цвет соответствует наличию у пациента стеноза ВСА 70% и более. Корреляционный анализ проводился непараметрическим методом с вычислением коэффициента Спирмена (ρ). Пороговый уровень двусторонней статистической значимости был выбран равным 0,05.

Результаты

Группы исследования и сравнения были сопоставимы по таким важным параметрам, как возраст, коморбидные состояния и приём основных групп препаратов (табл. 1). Не было различий и между частотой перенесённых ишемических нарушений мозгового кровообращения, включая ипсилатеральные (37,5% vs 26,5%; р = 0,6433). Распространённость нарушений углеводного обмена достоверно не различалась между группами (44% и 35%; p = 0,7931); также не было значимых отличий в степени компенсации сахарного диабета 2-го типа. Гендерное соотношение в группе пациентов с выраженным каротидным стенозом было более сдвинуто в сторону мужчин, что, однако, объясняется в целом преобладанием их в нашей когорте. Помимо этого необходимо отметить достаточно хорошую приверженность к назначенной терапии в обеих группах пациентов: так, антиагрегантную терапию (препараты ацетилсалициловой кислоты) принимали все пациенты со стенозами ВСА 70% и более и 85% пациентов из группы сравнения.

 

Таблица 1. Основные демографические и общеклинические параметры обследованных / Table 1. The main demographic and clinical characteristics of the study subjects

Параметр Parameter	Стеноз ≥70% Stenosis ≥70% (n = 16)	Стеноз <70% Stenosis <70% (n = 34)	p
Возраст, лет Age, years	64,5 [60, 3; 75, 3]	66 [62; 70]	0,9335
Индекс массы тела, кг/м2 Body mass index, kg/m2	27,0 [26, 2; 28, 4]	27,4 [25, 0; 29, 7]	0,876
Мужчины, n (%) Men, n (%)	11 (69%)	18 (53%)	0,4536
Сахарный диабет 2-го типа, n (%) Type 2 diabetes mellitus, n (%)	7 (44%)	12 (35%)	0,7931
Инсульт в анамнезе, n (%) History of stroke, n (%)	6 (37,5%)	9 (26,5%)	0,6433
Ипсилатеральное нарушение мозгового кровообращения, n (%) Ipsilateral cerebrovascular accident, n (%)	5 (31%)	8 (23,5%)	0,8142
Ишемическая болезнь сердца, n (%) Ischaemic heart disease, n (%)	8 (50%)	9 (26,5%)	0,1874
Инфаркт миокарда в анамнезе, n (%) History of myocardial infarction, n (%)	4 (25%)	6 (17,6%)	0,8201
Фибрилляция предсердий, n (%) Atrial fibrillation, n (%)	0 (0%)	4 (11,7%)	0,3834
Приём ацетилсалициловой кислоты, n (%) Aspirin use, n (%)	16 (100%)	29 (85%)	0,2663
Приём статинов, n (%) Statin use, n (%)	15 (94%)	28 (82%)	0,6952
Атеросклероз других локализаций, n (%) Atherosclerosis in other locations, n (%)	15 (94%)	14 (41%)	0,001

 

Единственным статистически значимым различием между группами стало более выраженное распространение атеросклеротического процесса у пациентов с каротидными стенозами высоких градаций — так, почти у всех пациентов основной группы выявлялся атеросклероз других локализаций, в то время как в группе сравнения таких пациентов было менее половины (41%; р = 0,001).

Исследуемые группы были сопоставимы по основным показателям липидного профиля и гемостаза (табл. 2). Несколько более благоприятная картина по уровню общего холестерина и липопротеинов высокой плотности у пациентов с выраженными стенозами ВСА может быть связана с более высокой частотой приёма липид-снижающей терапии (94% vs. 82%; p > 0,05).

 

Таблица 2. Отдельные результаты липидограммы и коагулограммы / Table 2. Selected results from the lipid profile and coagulation profile

Параметр Parameter	Стеноз ≥70% Stenosis ≥70% (n = 16)	Стеноз <70% Stenosis <70% (n = 34)	p
Общий холестерин, ммоль/л Total cholesterol, mmol/liter	4,7 [4, 3; 5, 6]	5,2 [4, 4; 6, 9]	0,323
Триглицериды, ммоль/л Triglycerides, mmol/liter	1,3 [0, 9; 2, 1]	1,8 [1, 2; 2, 0]	0,625
Липопротеины высокой плотности, ммоль/л High density lipoproteins, mmol/liter	1,8 [1, 5; 2, 2]	1,7 [1, 4; 2, 1]	0,5394
Липопротеины низкой плотности, ммоль/л Low density lipoproteins, mmol/liter	2,2 [1, 7; 2, 8]	2,2 [1, 3; 2, 7]	0,5886
Фибриноген, г/л Fibrinogen, g/liter	3,5 [3, 0; 4, 1]	3,6 [3, 1; 4, 2]	0,7472
Активированное частичное тромбопластиновое время, с Activated partial thromboplastin time, sec	28,9 [27, 3; 33, 0]	28,2 [25, 3; 29, 5]	0,1162

 

Уровень лейкоцитарной экспрессии исследованных микроРНК наглядно представлен на рис. 1, а детали приведены в табл. 3.

 

Рис. 1. Уровень лейкоцитарной экспрессии микроРНК у пациентов в зависимости от степени каротидного стеноза (представлен в виде совмещенного violin plot [распределение данных и плотность вероятности] и box-plot [прямоугольник — межквартильный интервал, горизонтальная линия — медиана, вертикальные линии — разброс]). / Fig. 1. Leukocyte microRNA expression level in patients, depending on the degree of carotid stenosis (shown as a combined violin plot [data distribution and probability density] and box plot [rectangle — interquartile interval, horizontal line — median, vertical lines — spread]).

 

Таблица 3. Уровень лейкоцитарной экспрессии микроРНК (×10⁶ копий) у обследованных / Table 3. Leukocyte microRNA expression level (×10⁶ copies) in the study subjects

МикроРНК MicroRNA	Стеноз ≥70% Stenosis ≥70% (n = 16)	Стеноз <70% Stenosis <70% (n = 34)	p
miR-126-5p	4,8 [4, 6; 5, 4]	8,5 [6, 7; 10, 4]	<0,001
miR-126-3p	5,9 [5, 2; 6, 6]	7,6 [6, 9; 10, 5]	<0,001
miR-29-5p	26,4 [24, 5; 30, 1]	28,6 [24, 6; 32, 6]	0,3383
miR-29-3p	7,6 [6, 6; 8, 9]	10,3 [8, 7; 13, 3]	<0,001
miR-33a-5p	46,3 [41, 3; 48, 4]	40,0 [36, 8; 45, 4]	0,01078
miR-33a-3p	42,0 [41, 3; 45, 9]	42,0 [36, 7; 43, 4]	0,08045
miR-21-5p	9,1 [7, 5; 9, 8]	9,7 [7, 6; 12, 1]	0,3439
miR-21-3p	9,2 [8, 3; 10, 5]	11,1 [8, 4; 12, 1]	0,08235

 

Основные статистически значимые различия продемонстрировали miR-126-5p/-3p, miR-29-3p (снижение их экспрессии у пациентов с выраженным стенозом) и miR-33a-5p (гиперэкспрессия в группе со стенозом 70% и более). Примечательно, что уровень экспрессии основной части исследованных микроРНК, образующихся с противоположных концов одной пре-микроРНК и обозначаемых -5р и -3р, был сопоставим между собой, за исключением miR-29, у которой экспрессия -5p варианта была практически в 3 раза выше, чем у парной микроРНК.

Для идентификации возможных кластеров по уровню экспрессии микроРНК была сформирована тепловая карта (рис. 2). На ней достаточно чётко визуализируются по крайней мере два кластера с сопоставимыми паттернами экспрессии микроРНК: верхняя четверть характеризуется сниженной экспрессией miR-33a-3p/-5p и более высокой — miR-126-5p/-3p, miR-29-3p и miR-21-5p/-3p (здесь представлены только пациенты со каротидным стенозом менее 70%); а в нижней четверти наблюдается обратная картина — гиперэкспрессия miR-33a-3p/-5p вкупе со сниженной экспрессией всех остальных исследованных микроРНК (в этой части абсолютное большинство — пациенты с каротидными стенозами высокой градации).

 

Рис. 2. Тепловая карта относительной экспрессии микроРНК. Синяя гамма отражает более низкие уровни экспрессии, жёлтая — более высокие, столбец «Стеноз» — распределение пациентов по степени каротидного стеноза (более тёмный цвет — стеноз 70% и более). Представленные дендрограммы отражают процесс иерархической кластеризации. / Fig. 2. Heat map of the relative microRNA expression. The blue indicates lower levels of expression and the yellow indicates higher levels. The “Stenosis” column is the patient distribution according to the degree of carotid stenosis (the darker colour corresponds to ≥70% stenosis). The provided dendrograms reflect the process of hierarchical clustering.

 

Помимо этого, был проведён корреляционный анализ (рис. 3), который не продемонстрировал статистически значимой связи между большей частью пар показателей. Выявлены ожидаемые прямые корреляции между уровнями экспрессии пар микроРНК (например, между miR-21-3p и miR-21-5p; ρ = 0,71; р < 0,05), а также отсутствие таковой для miR-29-3p и miR-29-5p (ρ = 0,2; р > 0,05). Выделяются на этом фоне значимые отрицательные корреляции между степенью стеноза и экспрессией miR-126-5p (ρ = –0,83; р < 0,05), miR-126-3p (ρ = –0,64; р < 0,05) и miR-29-3p (ρ = –0,62; р < 0,05).

 

Рис. 3. Корреляционный анализ. В ячейках указаны коэффициенты ранговой корреляции Спирмена (ρ), цвет ячейки зависит от направления (синий оттенок — отрицательная, жёлтый — положительная, зелёный — близкие к 0) взаимосвязи, а также её выраженности (интенсивность соответствующего оттенка). Зачёркнуты незначимые корреляции (p > 0,05). / Fig. 3. Correlation analysis. The cells contain Spearman's rank correlation coefficient (ρ), the cell colour depends on the direction (blue is negative, yellow is positive, green is close to 0) of the correlation, as well as its significance (intensity of the corresponding shade). Non-significant correlations are crossed out (p > 0.05).

 

Обсуждение

Атеросклеротическая ЦВП является одной из наиболее важных подгрупп сосудистых заболеваний нервной системы. Разработаны и внедрены широкие возможности её профилактики — как медикаментозной, так и хирургической/ангиореконструктивной. Высокую социально-экономическую значимость этой патологии придаёт большое число потенциально корригируемых факторов риска, в числе которых курение, сахарный диабет, артериальная гипертония, диета, образ жизни, загрязнение окружающей среды и др. [1]. В многочисленных исследованиях идентифицированы различные звенья атерогенеза, однако основные молекулярные механизмы и возможности прецизионной биомаркерной диагностики до сих пор не реализованы на практике в полной мере.

В нашем исследовании на относительно небольшой когорте пациентов с ЦВП на фоне КА показан дифференцированный паттерн экспрессии ряда микроРНК, ассоциированных с КА в зависимости от степени стеноза. В качестве основного разделения на группы нами был выбран уровень 70% стеноза ВСА, поскольку когорта пациентов с выраженным каротидным стенозом является более угрожаемой по развитию инсульта, чем, например, пациенты со стенозом ВСА в диапазоне 50–69% — по данным метаанализа [8], отношение рисков составило 2,1 (95% ДИ 1,7–2,5). Применённые в работе методики статистической обработки и визуализации данных позволили условно выделить две группы микроРНК: экспрессия одних повышается в группе выраженного стеноза (miR-33a-3p/-5p, «проатерогенные»), экспрессия других — снижается (miR-126-5p/-3p, miR-29-3p и miR-21-5p/-3p, «атеропротективные»).

MiR-33a активно вовлечена в метаболизм липидов (в том числе путём замедления выведения холестерина из макрофагов вследствие подавления экспрессии ABCA1 [9]), а использование антагонистов к ней (так называемых антагомиров) в экспериментальных животных моделях приводило к повышению уровня ЛПВП сыворотки и снижению содержания холестерина в периферических тканях [10]. Дефицит miR-33a приводил к замедлению и регрессу атеросклеротического поражения у apoE^–/apoE^–-мышей [11]. Интересными представляются также данные о снижении эндогенного амилоида β в головном мозге на фоне дефицита miR-33a [12]. В представленной нами когорте miR-33a была одной из наиболее экспрессируемых микроРНК — в особенности, у пациентов с выраженными каротидными стенозами, что позволяет рассматривать её в качестве значимого биомаркера КА.

Семейство микроРНК miR-29 играет важную роль в ремоделировании и повреждении сосудистой стенки путём регуляции синтеза коллагена, воспалительной реакции и иных генов внеклеточного матрикса [13]. Экспрессия miR-29 также ассоциирована с эндотелиальной дисфункцией на фоне гипергликемии [14]. В некоторых исследованиях, однако, получены противоположные результаты — так, в работе Y. Huang и соавт. уровни циркулирующей miR-29 были выше в группе пациентов с асимптомным КА [15]. Помимо этого, в экспериментальной модели атеросклероза введение антагонистов miR-29 вело к стабилизации и регрессу атеросклеротической бляшки [16]. При этом в других работах (в частности, [17]) определена протективная роль miR-29a-3p, снижавшей уровень эндотелиальной дисфункции (концентрации VCAM-1, ICAM-1 и E-селектина), индуцированной фактором некроза опухоли-α. Подобные противоречия в целом подтверждаются нашими данными, поскольку -3p и -5p варианты miR-29 экспрессировались неоднородно (в отличие от других пар микроРНК); более того, это была единственная микроРНК, у которой отсутствовала корреляция между уровнями экспрессии её вариантов. Это подчёркивает необходимость определения обоих вариантов miR-29 в дальнейших исследованиях.

МiR-126 была одной из первых открытых микроРНК, которые специфичны для сосудистой системы и играют критическую роль в её развитии (ангиогенезе). Уровень miR-126 снижается при достаточно большом числе сосудистых заболеваний и опухолей, а повышение её экспрессии благоприятно для таких патологий, как ишемическая болезнь сердца, атеросклероз, диабетическая ангиопатия и др. [18]. Экспрессия miR-126-3p/-5p оказалась наиболее значимо сниженной в группе пациентов с выраженными каротидными стенозами, что подтверждает тезис об атеропротективной роли указанной микроРНК. Одним из потенциальных механизмов такого эффекта может служить подавление miR-126 молекулы клеточной адгезии VCAM-1, необходимой для инициации процесса лейкоцитарной инфильтрации сосудистой стенки [19]. Также в нашем исследовании именно уровни экспрессии miR-126-5p/-3p продемонстрировали наибольшую отрицательную корреляцию со степенью каротидного стеноза (ρ = –0,83 и ρ = –0,64 соответственно; p < 0,05).

MiR-21 описывается как «механо-микроРНК», подразумевая её роль в модуляции реакции сосудистой стенки на изменения напряжения сдвига тока крови. Дефицит miR-21 ведёт к нарушению пролиферации гладкомышечных клеток сосудов (что выражается в нарушении их ремоделирования), а также раннему развитию атеросклероза, некроза ядра атеросклеротической бляшки и поддержанию воспалительной реакции [20]. Экспрессия miR-21 резко снижена в области фиброзной покрышки разорвавшихся атеросклеротических бляшек, а ультразвук-направленная доставка аналогов miR-21 вела к стабилизации бляшки [21]. С другой стороны, у пациентов с артериальной гипертонией гиперэкспрессия miR-21 была сопряжена с эндотелиальной дисфункцией, снижением концентрации оксида азота и его метаболитов [22]. В нашей работе получены в целом нейтральные результаты в отношении разницы уровней miR-21 между группами, однако на тепловой карте показан кластер пациентов без выраженного каротидного стеноза с относительной гиперэкспрессией этой микроРНК.

К ограничениям настоящего исследования следует отнести малый объем выборки, потенциально недостаточная её репрезентативность, возможное влияние неучтённых нами факторов на уровень экспрессии микроРНК.

Заключение

Результатом проведённого исследования пациентов с различной степенью КА (разделение групп — по стенозу ВСА 70%) стало описание паттерна экспрессии ряда микроРНК, ассоциированных с различными патогенетическими этапами атерогенеза. На основании полученных данных представляется возможным разделить исследованные микроРНК на условно проатерогенные (miR-33a-5p/-3p) и атеропротективные (miR-126-5p/-3p, miR-29-3p, mir-21-5p/-3p). Продемонстрированные закономерности определяют необходимость дальнейшего изучения роли микроРНК при атеросклеротической ЦВП, расширения когорты пациентов за счёт клинических разновидностей изучаемой патологии, а также проспективного наблюдения с целью оценки риска прогрессирования КА и развития острых нарушений мозгового кровообращения.

About the authors

Anton A. Raskurazhev

Research Center of Neurology

Author for correspondence.
Email: rasckey@live.com
ORCID iD: 0000-0003-0522-767X

Cand. Sci. (Med.), neurologist, researcher, 1st Neurology department

Russian Federation, Moscow

Alla A. Shabalina

Research Center of Neurology

Email: ashabalina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9604-7775

D. Sci. (Med.), leading researcher, Head, Laboratory of hemorheology, hemostasis and pharmacokinetics (with clinical laboratory diagnostics)

Russian Federation, Moscow

Polina I. Kuznetsova

Research Center of Neurology

Email: angioneurology0@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4626-6520

Cand. Sci. (Med.), neurologist, researcher, 1^st Neurology department

Russian Federation, Moscow

Marine M. Tanashyan

Research Center of Neurology

Email: M_Tanashyan2004@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5883-8119

D. Sci. (Med.), Prof., Corresponding member of RAS, Deputy Director for science, Head, 1^st Neurological department

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files