Modelling motor and non-motor signs of early-stage Parkinson's disease

Full Text

Введение

На ранних стадиях развития болезни Паркинсона (БП) до проявления моторных нарушений наблюдаются признаки дисфункции вегетативной нервной системы, включающие разнообразные нарушения со стороны пищеварительной системы: гиперсаливацию, замедление скорости эвакуации содержимого желудка и моторики кишки, запоры и затруднённую дефекацию [1, 2]. Патоморфологически БП характеризуется патологической агрегацией и распространением белка α-синуклеина в структурах ЦНС и периферической нервной системы. Накопление патологического белка и нарастание симптомов болезни вовлекает на ранних стадиях заболевания желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) и ядра продолговатого мозга, а затем чёрное вещество и высшие отделы головного мозга [3]. Согласно гипотезе H. Braak [4], распространение патологических форм α-синуклеина из структур периферической нервной системы происходит по эфферентным холинергическим вагальным волокнам в дорсальные моторные ядра блуждающего нерва. Эта гипотеза подтверждается данными патоморфологических исследований больных БП [5, 6] и экспериментальными исследованиями на животных [7].

В моделировании БП in vivo применяют два основных подхода: создание генетических моделей на основе известных мутаций, ассоциированных с паркинсонизмом, и введение лабораторным животным различных нейротоксинов, оказывающих селективное воздействие на дофаминовую нигростриатную систему головного мозга. Особый интерес представляют модели с использованием гербицида параквата и пестицида ротенона.

Ротенон является специфическим ингибитором комплекса I митохондриальной электронно-транспортной цепи [8]. Данные эпидемиологических исследований свидетельствуют о повышении риска развития БП при длительном контакте с ротеноном [9]. При системном введении ротенона грызунам удаётся воспроизвести основные симптомы БП: моторные нарушения, нейродегенерацию в нигростриатной системе и накопление в нейронах патологической формы α-синуклеина [10, 11]. Длительное интрагастральное введение ротенона мышам позволяет моделировать периферическое начало развития БП (поражение структур нервной системы кишечника) с последующим распространением патологического процесса в ЦНС [12, 13]. Однако в литературе не описана аналогичная модель на крысах, позволяющая воспроизводить раннюю стадию БП с длительным развитием заболевания. Использование крыс в качестве модельных животных имеет ряд преимуществ, в том числе удобство манипуляций, более крупные размеры животного и, соответственно, исследуемых анатомических структур, потенциальную возможность исследования более сложных паттернов поведения.

БП прогрессирует годами и десятилетиями, но уже на самых ранних этапах этого заболевания более чем у половины пациентов наблюдаются вегетативные расстройства, в том числе различные нарушения функций ЖКТ. Воспроизведение на животных длительного прогрессирования БП позволяет провести комплексную оценку закономерностей морфофункциональных изменений в ЖКТ на начальных этапах патологического процесса, что имеет большое значение для разработки методов ранней диагностики БП, лечения вегетативных расстройств, ассоциированных с паркинсонизмом, а также повышения качества жизни пациентов.

Цель работы: на модели ранней стадии БП с длительным пероральным введением крысам нейротоксина ротенона в малых дозах исследовать функциональные и иммуногистохимические изменения ЖКТ экспериментальных животных и изменения нигральных стволовых структур.

Материалы и методы

Ротеноновая модель

Самцам крыс Вистар в возрасте 3,0–3,5 мес (n = 10) вводили перорально ротенон («Sigma») в виде суспензии в 4% растворе карбоксиметилцеллюлозы в дозе 5 мг/кг через день в течение 7 мес (опытная группа). Крысы контрольной группы (n = 10) получали только 4% карбоксиметилцеллюлозу. Была выбрана доза 5 мг/кг, поскольку такая дозировка использовалась в аналогичной модели на мышах [12, 13].

Физиологические исследования

В начале и в конце эксперимента (перед выведением животных из эксперимента) проводили оценку двигательной активности животных с помощью тестов «открытое поле» и «сужающаяся дорожка». В тесте «открытое поле» с помощью установки «Opto-Varimex» («Columbus Instruments») измеряли общую длину дистанции пробега за 5 мин. В тесте «сужающаяся дорожка» оценивали количество нарушений прохождения сужающейся дорожки (груминг, изменение направления движения, остановка на дорожке, свешивание, фризинг, срыв с дорожки), выраженное в баллах, и процент оступаний правыми и левыми конечностями животных от общего количества шагов.

Скорость эвакуации содержимого желудка и моторику тонкой кишки исследовали путём введения животным за 20 мин до декапитации 5% раствора красителя Evans blue на 4% растворе карбоксиметилцеллюлозы с последующим замером дистанции распространения красителя от привратника в каудальном направлении.

Иммуногистохимическое исследование

Контрольных и экспериментальных крыс наркотизировали эфиром и декапитировали. Для оценки плотности расположения дофаминовых нейронов в чёрном веществе, плотности расположения нервных волокон в мышечной оболочке, содержания общего α-синуклеина и GFAP-позитивной глии в миэнтеральных ганглиях использовали криостатные срезы головного мозга, содержащие чёрное вещество, и срезы тонкой кишки толщиной 10 мкм, приготовленные на криостате «Tissue-Tek Cryo3 Flex» («Sakura») с последующей иммунофлюоресцентной реакцией. Для выявления фосфорилированного α-синуклеина в структурах энтеральной нервной системы использовали тотальные препараты тонкой кишки, состоящие из серозной оболочки, внутреннего и наружного слоёв мышечной оболочки и межмышечного нервного сплетения, расположенного между ними.

Тотальные препараты готовили следующим образом: фрагмент кишки длиной 4–5 см разрезали в продольном направлении, закрепляли его в растянутом состоянии при помощи энтомологических игл на дне чашки Петри с фосфатным буфером (pH 7,3–7,4), покрытом парафином, слизистой оболочкой вверх, затем под лупой удаляли слизистую оболочку при помощи глазного пинцета. Иммунофлюоресцентные реакции проводили на кусочках полученных тотальных препаратов размером приблизительно 1 × 1,5 см методом «плавающих срезов» в микропробирках.

Для иммунофлюоресцентных реакций использовали первичные антитела к β-III-тубулину (мышиные антитела, «Biolegend»), тирозингидроксилазе (ТН) (кроличьи антитела, Sigma), ацетилхолинтрансферазе (Chat) (козьи антитела, «Chemicon»), вазоинтестинальному пептиду (VIP) (кроличьи антитела, «Abcam»), глиальному кислому фибриллярному белку (GFAP) (мышиные антитела, «Sigma»), общему α-синуклеину (кроличьи антитела, «Sigma») и α-синуклеину, фосфорилированному по серину-129 (мышиные антитела клона Psyn/81A, «Abcam») в разведении 1 : 250, а также вторичные антитела («Sigma»), меченные флюорохромами CF448 и Cy3 в разведении 1 : 100. Препараты исследовали и фотографировали под микроскопом «NikonEclipse NiU» с цифровой камерой «Nikon DS-Qi». Морфометрию выполняли на фотографиях в программах «NIS Elements» и «ImageJ», производя не менее 30–40 измерений на животное для каждого из количественно определяемых параметров.

Оценивали количество β-III-тубулин-позитивных нервных волокон в мышечной оболочке на площади среза 100 мкм². Количество ТН-позитивных нервных волокон на 100 мкм² в межмышечном сплетении определяли на тотальных препаратах. Содержание общего α-синуклеина и GFAP-позитивной глии в миентеральных ганглиях оценивали косвенно, выделяя на фотографии область ганглия вручную, путём измерения средней интенсивности флюоресцентного окрашивания при помощи параметра «mean gray value» в программе «ImageJ» (с коррекцией на фоновое окрашивание). В чёрном веществе головного мозга животных на срезах оценивали плотность распределения тел ТН-позитивных нейронов, подсчитывая количество нейронов на 0,01 мм² площади чёрного вещества. На тотальных препаратах при помощи двойного иммуномечения выявляли наличие колокализации фосфо-α-синуклеина в основных популяциях миэнтеральных нейронов (возбуждающих и тормозных), выявляемых с помощью антител к Chat и VIP соответственно, а также в адренергических симпатических волокнах, выявляемых с помощью антител к ТН.

Статистичеcкий анализ проводили в программе «Statistica 6.0». Результаты представлены в виде среднего и стандартной ошибки среднего (M ± m). Сравнение исследуемых параметров между контрольной и экспериментальной группами проводили при помощи критерия Манна–Уитни. Различия признавали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты исследования

Физиологические тесты

У крыс опытной группы в тесте «открытое поле» не выявлено статистически значимого снижения двигательной активности, однако в тесте «сужающаяся дорожка» процент оступаний (соскальзываний на нижнюю планку установки) левыми конечностями у них был достоверно выше, чем у крыс контрольной группы (46 ± 9,1 и 26 ± 5,1%; p < 0,05; рис. 1, A); также в этой группе было увеличено по сравнению с контролем количество нарушений прохождения сужающейся дорожки (10 ± 1,2 и 2 ± 0,8 балла; p < 0,05; рис. 1, B).

 

Рис. 1. Моторные и нейродегенеративные изменения у крыс при длительном введении ротенона. А — количество оступаний правыми и левыми конечностями (% от общего количества шагов) животных контрольной и опытной групп в тесте «сужающаяся дорожка»; B — количество нарушений прохождения сужающейся дорожки, баллы; С — дистанция распространения красителя Evans Blue от привратника желудка в каудальном направлении по тонкой кишке через 20 мин после перорального введения красителя, см; D — количество ТН-позитивных нейронов в компактной части чёрного вещества на поле зрения; E — ТН-позитивные нейроны в компактной части чёрного вещества крысы контрольной группы, × 10; F — ТН-позитивные нейроны в компактной части чёрного вещества крысы опытной группы, × 10; G — количество β-III-тубулин-позитивных нервных волокон в межмышечном сплетении тонкой кишки на поле зрения; H — количество ТН-позитивных нервных волокон в межмышечном сплетении тонкой кишки на 100 мкм². * — р < 0,05. / Fig. 1. Motor and neurodegenerative changes in rats after long-term administration of rotenone. A — number of paw slips with right and left limbs (% of total number of steps) in the control group and the rotenone group in the narrowing beam-walking test; B — number of errors in the narrowing beam-walking test, points; C — spread of Evans Blue dye from the pylorus caudally along the small intestine, 20 minutes after oral dye administration, cm; D — number of TH-positive neurons in pars compacta of the substantia nigra per field of view; E — TH-positive neurons in pars compacta of the substantia nigra of control animals, × 10; F — TH-positive neurons in pars compacta of the substantia nigra of experimental animals, × 10; G — number of β-III-tubulin positive nerve fibres in the Auerbach's plexus of the small intestine per field of view; H — number of TH-positive nerve fibres in the Auerbach's plexus of the small intestine per 100 μm².

 

Оценка скорости эвакуации содержимого желудка и моторики тонкой кишки путём измерения дистанции прохождения красителя Evans Blue от привратника желудка в каудальном направлении по тонкой кишке через 20 мин после перорального введения красителя показала достоверное снижение этого показателя у крыс опытной группы по сравнению с контролем (61,5 ± 2,7 и 87,8 ± 8,7 см; p < 0,05; рис. 1, C).

Иммуногистохимическое исследование

В чёрном веществе количество ТН-позитивных нейронов на 0,01 мм² площади среза компактной части чёрного вещества у крыс опытной группы было достоверно ниже, чем в контроле (5,42 ± 0,3 и 7,21 ± 0,3; p < 0,05, рис. 1, D–F).

При общем гистологическом исследовании образцов тонкой кишки крыс опытной группы не обнаружено атрофических, некротических изменений, явных признаков воспаления слизистой оболочки. В межмышечном сплетении тонкого кишечника у крыс опытной группы по сравнению с контролем было достоверно снижено количество и β-III-тубулин-позитивных (0,18 ± 0,01 и 0,29 ± 0,01; p < 0,05; рис. 1, G), и ТН-позитивных (0,61 ± 0,03 и 0,86 ± 0,03; p < 0,05; рис. 1, H) нервных волокон на 100 мкм².

Общий α-синуклеин обнаружен в элементах межмышечного и подслизистого сплетений, нервных волокнах в слизистой оболочке, волокнах, оплетающих сосуды артериального русла, у крыс как контрольной, так и опытной группы (рис. 2, A–D). В ганглиях он локализовался преимущественно претерминально, в варикозностях, окружающих тела ганглионарных нейронов, а также в телах небольшого количества нейронов. В опытной группе выявлено значительное повышение интенсивности иммунофлюоресцентного окрашивания на общий α-синуклеин в ганглиях межмышечного сплетения тонкой кишки по сравнению с контролем (11,05 ± 0,5 и 4,22 ± 0,5 усл. ед.; p < 0,05; рис. 2, Е), что позволяет предположить увеличение экспрессии этого белка в нервных элементах кишечника на этой модели.

 

Рис. 2. Общий α-синуклеин (α-syn) в нервной системе кишечника крыс при длительном введении ротенона. A–D — локализация общего α-синуклеина в β-III-тубулин-позитивных структурах нервной системы кишечника крысы опытной группы, × 20; А — иммунофлюоресцентное окрашивание на ядра клеток (DAPI, синий); В — иммунофлюоресцентное окрашивание на β-III-тубулин (красный); C — иммунофлюоресцентное окрашивание на общий α-синуклеин (красный); D — результат наложения изображений А–С. Области колокализации маркеров β-III-тубулина и общего α-синуклеина — жёлтый, оранжевый; E — интенсивность иммунофлюоресцентного окрашивания на общий α-синуклеин в ганглиях межмышечного сплетения, усл. ед. *р < 0,05. / Fig. 2. Total alpha-synuclein (α-syn) in the enteric nervous system of rats after long-term administration of rotenone. A–D — the location of total α-synuclein in the β-III-tubulin positive structures of the enteric nervous system in an experimental animal, × 20; А — immunofluorescence staining of cell nuclei (DAPI, blue); В — immunofluorescence staining of β-III-tubulin (red); C — immunofluorescence staining of total α-synuclein (red); D — the result of overlaying images А–С. Areas of β-III-tubulin and total α-synuclein colocalization are yellow and orange. E — intensity of immunofluorescence staining of total α-synuclein in the Auerbach's plexus ganglion cells, C.U. *р < 0.05.

 

Иммунофлюоресцентное окрашивание с помощью антител к фосфорилированному α-синуклеину клона Psyn/81A колокализовалось с Chat-позитивными (рис. 3, A–C) и ТН-позитивными (рис. 3, F), но не с VIP-позитивными элементами энтеральной нервной системы (рис. 3, D, E).

 

Рис. 3. Локализация фосфорилированного α-синуклеина (α-synP) в структурах межмышечного сплетения тонкой кишки. А–С — колокализация фосфорилированного α-синуклеина в холинергических нейронах межмышечного сплетения (жёлтые стрелки указывают на тела нейронов, в которых наблюдается колокализация), × 20; D, E — иммунофлюоресцентное окрашивание на VIP (зелёный цвет, зелёные стрелки) и фосфорилированный α-синуклеин (красный цвет, красные стрелки) в межмышечном сплетении: отсутствие колокализации, × 40; F — иммунофлюоресцентное окрашивание на TH (зелёный) и фосфорилированный α-синуклеин (красный) в межмышечном сплетении: колокализация в отдельных волокнах (жёлтые стрелки), × 40; G — иммунофлюоресцентное окрашивание на GFAP (красный, красная стрелка) и общий α-синуклеин (зелёный, зелёная стрелка) в ганглии межмышечного сплетения: отсутствие колокализации, × 40; H — интенсивность иммунофлюоресцентного окрашивания на GFAP в ганглиях межмышечного сплетения, усл. ед. * — р < 0,05. / Fig. 3. Location of phosphorylated α-synuclein (α-synP) in the Auerbach's plexus of the small intestine. А–С — colocalization of phosphorylated α-synuclein in cholinergic neurons of the Auerbach's plexus (yellow arrows indicate cell bodies with colocali- zation), × 20; D, E — immunofluorescence staining for VIP (green colour, green arrows) and phosphorylated α-synuclein (red colour, red arrows) in the Auerbach's plexus: no colocalization, × 40; F — immunofluorescence staining for TH (green) and phosphorylated α-synuclein (red) in the Auerbach's plexus: colocalization in individual fibres (yellow arrows), × 40; G — immunofluorescence staining for GFAP (red, red arrow) and total α-synuclein (green, green arrow) in the Auerbach's plexus ganglion cells: no colocalization, × 40; H — intensity of immunofluorescence staining for GFAP in the Auerbach's plexus ganglion cells, C.U. * — р < 0.05.

 

GFAP-позитивная глия выявлялась в межмышечном сплетении крыс и контрольной, и опытной группы. Она располагалась между нейронами, и её отростки, окружая тела нейронов, образовывали слой по периферии ганглия. Плотность расположения GFAP-позитивной глии в миэнтеральных ганглиях тонкой кишки, вычисленная путём измерения интенсивности флюоресценции, была ниже у крыс опытной группы по сравнению с контролем (27 ± 1,2 и 36 ± 1,2 усл. ед.; p < 0,05; рис. 3, G). Двойное мечение на общий α-синуклеин и GFAP не выявило колокализации этих маркеров ни в контроле, ни в эксперименте (рис. 3, H).

Обсуждение

Описанная в настоящей работе модель паркинсонизма с длительным введением крысам ротенона в малых дозах позволяет воспроизвести основные нарушения, характерные для БП: моторный дефицит и дегенерацию нейронов в чёрном веществе головного мозга. У экспериментальных животных выявлено нарушение координации движений, выражающееся в более частом, по сравнению с контролем, оступании левыми конечностями. Латерализация моторных симптомов характерна для пациентов на ранних стадиях БП, при этом по мере прогрессирования заболевания она может становиться менее выраженной [14]. Двигательная асимметрия имеет большую клиническую значимость для дифференциальной диагностики БП и других сходных паркинсонических синдромов. Вместе с тем общая двигательная активность, определяемая путём измерения средней дистанции пробега в тесте «открытое поле», не была снижена. Не выявлено и других симптомов, характерных для развернутой стадии БП (ригидность, характерная сгорбленная поза, снижение массы тела) и наблюдаемых обычно на «острых» моделях с введением больших доз нейротоксинов [15]. Таким образом, описанная в нашей работе модель воспроизводит начальную стадию БП.

Важно подчеркнуть, что данная модель воспроизводит функциональные и патоморфологические нарушения в ЖКТ, характерные для больных БП (в том числе в ранней моторной и премоторной её стадиях). Так, симптомы замедления опорожнения желудка и снижения моторики тонкой кишки, выявленные у животных после длительного введения ротенона, описаны у пациентов с БП [16, 17]; это же относится и к повышению интенсивности окрашивания на α-синуклеин в межмышечном сплетении [18].

Длительное введение ротенона вызывало снижение плотности расположения и общего количества нервных волокон, выявляемых с помощью β-III-тубулина, и ТН-позитивных нервных волокон в стенке тонкого кишечника. Ранее в пилотном исследовании мы выявили у крыс после 1 мес введения ротенона в той же дозировке снижение количества ТН-позитивных волокон в миэнтеральном сплетении, но не общего количества волокон [19]. ТН-позитивные волокна в тонкой кишке крыс представляют собой симпатические эфферентные волокна [20]. Таким образом, выявленная симпатическая денервация тонкой кишки предшествует дегенерации нервных волокон собственных энтеральных сплетений тонкой кишки, образующих основную массу β-III-тубулин-позитивных волокон.

При моделировании периферического развития паркинсонизма особый интерес представляет выявление уязвимых популяций нейронов и нервных волокон, которые могут являться первоначальным звеном в цепи патологических изменений и распространения в структуры ЦНС α-синуклеина. В нашем исследовании общий α-синуклеин был выявлен и у экспериментальных, и у контрольных животных, преимущественно в секреторных окончаниях аксонов, что согласуется с данными литературы [21], однако его содержание в ганглиях экспериментальных животных было значительно выше.

Для уточнения накопления и локализации фосфорилированной формы белка, ассоциированного с развитием БП, дополнительно на тотальных препаратах проведено двойное иммуномечение на фосфо-α-синуклеин и маркеры основных популяций миентеральных нейронов — возбуждающих и тормозных. Фосфорилированный α-синуклеин был выявлен в возбуждающих (Chat-позитивных), но не в тормозных (VIP-позитивных) элементах энтеральной нервной системы. Это указывает на уязвимость холинергических структур при развитии патологического процесса, связанного с повышением экспрессии, модификацией, агрегацией и распространением α-синуклеина, и, возможно, их поражение приводит к нарушению моторики тонкой кишки и замедлению кишечного транзита, наблюдаемого на данной ротеноновой модели.

Несмотря на то, что в нервных сплетениях кишечника имеются собственные холинергические нейроны, согласно данным литературы, лишь небольшое количество (13–22%) миэнтеральных нейронов позитивны к общему α-синуклеину, в то время как все преганглионарные волокна блуждающего нерва и их аксональные терминали содержат α-синуклеин [21]. Кроме того, было продемонстрировано, что после ваготомии количество α-синуклеин-позитивных аксонов и аксональных варикозностей в межмышечном сплетении снижалось вдвое [22]. Взятые вместе, эти данные позволяют полагать, что часть выявленных в нашем исследовании фосфо-α-синуклеин-позитивных холинергических волокон энтеральных сплетений тонкой кишки, вероятно, являются эфферентными волокнами блуждающего нерва. Это косвенно указывает на возможную роль блуждающего нерва в патологическом процессе, связанном с накоплением и распространением патологических форм α-синуклеина в структуры ЦНС. Кроме того, фосфорилированный α-синуклеин был выявлен и в некоторых ТН-позитивных волокнах, что, возможно, свидетельствует о вовлечении на ранней стадии в патологический процесс симпатической нервной системы, что требует дальнейшего изучения, в том числе исследования симпатических ядер спинного мозга. Необходимо также на данной модели провести количественную оценку содержания фосфо-α-синуклеина в нервных структурах различной эргичности, которая в настоящем исследовании была затруднена в связи с использованием тотальных препаратов кишки, имеющих слишком большую толщину и содержащих, помимо нервных элементов, серозную и мышечную оболочки, создающие значительное фоновое окрашивание.

Длительное оральное введение крысам ротенона в низкой дозе не вызвало реактивного глиоза в миэнтеральных ганглиях. Более того, интенсивность иммунофлюоресцентного окрашивания на GFAP у экспериментальных животных была снижена по сравнению с контролем, что согласуется с результатами, полученными на мышах при длительном подкожном введении им ротенона в малых дозах [23]. Вероятно, это снижение является следствием токсического воздействия ротенона на клетки ганглионарной глии. Однако одного снижения интенсивности иммунофлюоресцентного окрашивания на GFAP не достаточно для того, чтобы предполагать снижение количества глиальных клеток. Отсутствие реактивного глиоза также не позволяет утверждать об отсутствии нейродегенерации в миэнтеральных ганглиях, поскольку в рамках настоящего исследования специально не проводились количественные исследования нейронов. На предложенной модели клетки глии в ганглиях, по-видимому, не играют роли в процессах поглощения, накопления, распространения патологических форм α-синуклеина в структурах межмышечного сплетения, поскольку двойное иммуномечение на общий α-синуклеин (включающий нативную форму и посттрансляционно изменённые формы этого белка) и GFAP не выявило колокализации этих маркеров ни в контроле, ни в эксперименте. Эти результаты согласуются с данными работы [24], в которой авторы на модели с оральным введением мышам другого широко используемого токсина — параквата — не выявили в GFAP-позитивной глии включений фосфорилированной формы α-синуклеина.

Таким образом, в настоящей работе на предложенной модели ранней стадии паркинсонизма воспроизведены нарушения со стороны ЖКТ, сходные с таковыми у пациентов с БП. Их морфологическим субстратом является денервация кишечника с накоплением в структурах энтеральной нервной системы α-синуклеина.

About the authors

Mikhail V. Ivanov

Research Center of Neurology

Author for correspondence.
Email: ivanov@neurology.ru
ORCID iD: 0000-0001-5947-9093

junior researcher, Laboratory of neuromorphology

Россия, 125367, Moscow, Volokolamskoye shosse, 80

Kristina A. Kutukova

Research Center of Neurology

Email: Chrisbiomag@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5483-9157

junior researcher, Laboratory of neuromorphology

Россия, 125367, Moscow, Volokolamskoye shosse, 80

References

Supplementary files