Features of innate and adaptive immunity in patients with Parkinson's disease

Cover Page

Abstract

Introduction. T cells play a significant role in neuroinflammation in Parkinson's disease (PD). Gamma delta T cells are an under-researched 'minor' subpopulation of T cells. An assessment of the immune system in patients with PD, with a focus on γδТ cells, provides new data on the pathogenesis of neurodegenerative diseases.

The aim of the study was to examine the lymphocyte subpopulations, nonclassical γδТ cells, as well as cytokine production in patients with 3 stage PD complicated by motor fluctuations.

Materials and methods. We examined 20 patients with 3 stage PD receiving dopaminergic combination therapy (main group) and 20 age-matched patients with chronic cerebrovascular disease (comparison group). Considering the suspected role of chronic constipation in maintaining dysbiosis and chronic inflammation in patients with PD, the presence of constipation was an inclusion criterion for this study. The subpopulation profile of the peripheral blood lymphocytes was assessed using flow cytofluorometry, as well as cytokine levels using enzyme linked immunosorbent assay.

Results. It was found that the number of mature CD3+ T cells with αβ or γδ chains as the T-cell receptors (TCR) in the lymphocyte population was significantly lower in patients with PD — median 74% (57.3–83.5)) than in the comparison group (median 80% (73.0–86.0); р = 0.014. There was also a statistically significant reduction in the number of CD3+CD56+ natural killer (NK) T cells in the group of patients with PD vs. the comparison group — 4.7% (1.3–7.7) vs. 7.8% (0.8–24); р = 0.036. At the same time, the number of CD3CD56+ NK cells was significantly higher in the group of patients with PD (16.4% (9–34)) vs. the comparison group — 8.7% (5–15); р = 0.001. Moreover, the main group had a statistically significantly higher number of activated CD3CD8+ NK cells — 7% (4.5–13.5) vs. the comparison group — 3.5% (0.86–4.9); р < 0.001. Out of the total number of γδТ cells, the TCRγδ CD4+CD8 subpopulation was statistically smaller in the group of patients with PD — 13.6% (6.2–27.0) than in the comparison group — 29.8% (4.0–52.1); р = 0.016. The study of cytokine levels in the group of patients with PD showed a significant increase in the induced production of interleukin-1β (IL-1β), as well as a high (aberrant) spontaneous production of IL-10, which was 227.5 pg/ml in patients with PD when the normal range is 0–23 pg/ml. The correlation analysis showed that the TCRγδ CD4+CD8 subpopulation and cytokines in the group of patients with PD had a statistically significant (p = 0.048) negative correlation with the induced production of IL-10 (r = –0.745) and a significant (p = 0.042) positive correlation with the induced production of the pro-inflammatory cytokine IL-1β (r = 0.648). There was a trend towards increased spontaneous production of IL-10 (r = –0.602; p = 0.0506) as the level of the TCRγδ CD4+CD8 T helper cells decreased.

Conclusion. Changes were found in the blood of patients with PD, which indicate a chronic inflammatory process: increased number of CD3CD56+ NK cells, including activated CD3CD8+ cells, and increased production of pro-inflammatory cytokine IL-1β and anti-inflammatory cytokine IL-10. A decrease was found in the level of a minor subpopulation of γδT cells, TCRγδ CD4+CD8. The correlation found between this subpopulation and the production of pro- and anti-inflammatory cytokines indicates its role in regulation of chronic inflammation in PD.

Full Text

Введение

Болезнь Паркинсона (БП) является одной из значимых медицинских проблем XXI в. С целью разработки новых методов лечения предлагаются теории, объясняющие патогенез заболевания, основанные на изучении показателей как локального, так и системного воспаления, в том числе иммунологических. Исследование патогенеза БП выявило дисфункцию иммунной системы, в частности, врождённый нейровоспалительный ответ как потенциальный фактор предрасположенности к заболеванию [1–3].

В нейровоспалительной активности при БП существенную роль играет Т-клеточное звено иммунной системы [4]. В настоящее время активно изучается гетерогенная субпопуляция γδТ-лимфоцитов, доминирующая в слизистых оболочках и коже, сочетающая свойства и функции клеток как врождённого, так и адаптивного иммунитета.

Закладка эпителия тимуса происходит на 6-й неделе развития плода. Клетки-предшественники, мигрирующие в тимус из фетальной печени на 8-й неделе эмбрионального развития, созревают в γδТ-клетки с ограниченной вариабельностью Т-клеточного рецептора (T-cell receptor, TCR), эмигрируют из тимуса в эмбриональном периоде в кожу, слизистые оболочки языка и репродуктивную систему, в последующем самостоятельно поддерживаются локально. Потомки клеток-предшественников второй волны миграции из фетальной печени в тимус не покидают его, образуя резерв для срочной регенерации (при стрессе, воздействии повреждающих факторов). Позже в тимусе формируются γδТ-лимфоциты с более широким спектром специфичностей TCR, покидающие тимус после рождения (до 13 сут) и заселяющие слизистые оболочки различных органов.

После рождения прекоммитированные к развитию в Т-клетки лимфоциты, покидая костный мозг, мигрируют в тимус, где проходят основные этапы развития [5]. Этапы дифференцировки в тимусе включают стадию дубль-негативных CD4CD8-клеток (DN), более зрелая популяция имеет фенотип CD4+CD8+ — дубль-позитивные клетки, они слабо экспрессируют на мембране CD3. Зрелые тимоциты, как и периферические Т-клетки, экспрессируют один из корецепторов: CD3+CD4+CD8-хелперы, CD3+CD4CD8+-цитотоксические Т-лимфоциты. На стадии DN происходит дивергенция тимоцитов к дифференцировке в различные линии αβ или γδ, запускается основное событие дифференцировки Т-лимфоцитов — реаранжировка V-генов TCR в последовательности δ, γ, β [6]. Уже на стадии DN3 тимоцит экспрессирует γδTCR и быстро эмигрирует из тимуса. У человека вариабельные домены γδTCR кодируются тремя основными Vδ-генами и не менее чем шестью Vγ-генами, что обусловливает высокий полиморфизм γδTCR, большой потенциал к формированию разно-образных лиганд-связывающих участков [7]. Не более 5% от общего числа покинувших тимус Т-лимфоцитов составляют γδT-клетки. Большинство Т-клеток имеют TCR, которые содержат α- и β-цепи, взаимодействуют с пептидными антигенами, представляемыми в комплексе с молекулами системы HLA антигенпрезентирующими клетками (классические Т-лимфоциты). Популяция γδТ-лимфоцитов экспрессирует уникальный Т-клеточный рецептор, способный распознавать собственные и чужеродные антигены непептидной природы в отсутствие необходимых для презентации молекул I или II классов системы HLA [8].

γδТ-лимфоциты впервые были описаны в середине 1980-х гг. [9, 10]. В периферической крови взрослого человека γδТ-клетки составляют около 5% общего числа CD3+-Т-лимфоцитов. Во всех лимфоидных органах (тимус, селезенка, лимфатические узлы, миндалины), в эпителии репродуктивных органов, респираторного тракта, языка общее содержание γδТ-клеток также составляет менее 5% зрелых Т-лимфоцитов [11, 12]. Существуют корреляции экспрессии γδTCR с определёнными анатомическими зонами. Так, резидентные γδT-клетки с вариантами CD3+Vδ1+-TCR или CD3+Vδ3+-TCR доминируют в слизистых оболочках желудочно-кишечного, респираторного и урогенитального трактов, в крови основная субпопуляция Т-лимфоцитов имеет Vγ9Vδ2-TCR [13].

Активация и функциональная активность γδT-клеток определяется экспрессией на мембране различных рецепторов, в том числе рецепторов клеток врождённого иммунитета. Так, γδT-клетки экспрессируют активационные рецепторы натуральных клеток-киллеров NKG2D, которые при взаимодействии с лигандами — белковыми молекулами, «инфицированных» внутриклеточными возбудителями и опухолевых клеток, реализуют цитотоксическую функцию, т.е. противовирусную, противоопухолевую защиту. Киллинг этих клеток-мишеней γδT-лимфоцитами через индукцию апоптоза, опосредованный перфорин–гранзим, Fas–Fas-лиганд, TNF–TNFR1 (tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1A) взаимодействием — особенность этой субпопуляции лимфоцитов. Активация супрессирую-щих рецепторов CD94/NKG2A и CD94/NKG2C на мембране γδT-клеток подавляет киллинг клеток-мишеней [14].

На мембране γδT-клеток определены рецепторы, распоз-нающие патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (общие структурные особенности, свойственные группам молекул чужеродных и опасных микроорганизмов): Толл-подобные рецепторы (TLR), рецепторы к полисахаридам бактерий, грибам, CD36, скэвенджер-рецепторы, обусловливающие участие этих клеток в антибактериальной защите. При контактах с бактериями эта субпопуляция может менять регуляторную функцию (продукция цитокинов) на антигенпрезентирующую, т.к. экспрессирует антигены НLAII класса, необходимые для эффективной презентации антигенов классическим СD4+-Т-хелперам, что свидетельствует о функциональной пластичности γδT-клеток. Популяция Vγ9Vδ2 Т-лимфоцитов распознает фосфатные антигены pAgs, которые имеют микробное происхождение или являются эндогенными промежуточными продуктами мевалонатного пути (изопренилпирофосфат) и накапливаются в клетках, «инфицированных» вирусами, и опухолевых клетках. Vγ9Vδ2 Т-лимфоциты осуществляют иммунный надзор, инициируя поликлональные ответы на pAgs после взаимодействия TCR с экспрессированным на клетке-мишени бутирофилином — членом семейства BTN3A1/CD277 [15].

γδТ-клетки экспрессируют на мембране рецепторы цитокинов интерлейкинов (ИЛ) -2R, -15R, -23R и др., которые активируют и способствуют реализации функциональной активности или супрессируют эффекторные функции этих клеток, в том числе пролиферативную и регуляторную [8]. Активация γδT-клеток через TCR стимулирует продукцию интерферона-γ (ИФН-γ), ИЛ-17, фактора некроза опухоли (ФНО), CCL3/4, CCL5, которые являются промоторами активации и миграции других клеток иммунной системы в зону воспаления; активация через костимуляторные молекулы CD27, CD30 способствует продукции ИФН-γ и ИЛ-4. Функциональные фенотипы γδ: γδT1-клетки, продуцирующие ИФН-γ, и γδT17-клетки, синтезирующие ИЛ-17, генерируются в течение пренатального тимического развития.

Коммитированная к продукции ИЛ-17 субпопуляция γδT-лимфоцитов характеризуется экспрессией ИЛ-23R, CCR6 и отсутствием CD27 на клеточной мембране. Супрессию нейроиммунного воспаления при БП реализует противовоспалительный цитокин ИЛ-10, в крови он продуцируется клетками врождённого иммунитета (дендритными, макрофагами, эозинофилами, нейтрофилами, тучными клетками, NK-клетками) и клетками адаптивного иммунитета — T-хелперами: Th1, T2, Th17, T- и B-регуляторными клетками [16, 17]. В центральной нервной системе ИЛ-10 экспрессируется клетками микроглии, астроцитами и нейронами [18, 19]. ИЛ-10 ингибирует продукцию ФНО, ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12 и ИЛ-23, пролиферацию и синтез цитокинов Th1 (ИЛ-2 и ИФН-γ), Th2 (ИЛ-4, ИЛ-5), но не супрессирует синтез ИЛ17 Th17 [20, 21].

Роль γδТ-клеток в иммунном ответе на чужеродные антигены, противоопухолевой защите, патогенезе аутоиммунных заболеваний характеризуется некоторыми особенностями. γδТ-клетки способны распознавать различные типы антигенов, спонтанно продуцировать цитокины, обладают различными и уникальными функциями, в том числе антигенпрезентирующей, привержены к определённой анатомической локализации. Им принадлежит решающая роль в защите от специфических патогенов, они способны к активации дендритных клеток.

Несмотря на то, что γδТ-клетки являются «минорной» субпопуляцией, между их количеством и вариантами течения/исходами заболеваний были выявлены значимые корреляции [22–24]. Так, содержание γδТ-клеток резко возрастает (до 60% от общего количества Т-клеток) в крови больных с различными инфекционными заболеваниями [25–27]. γδТ-лимфоциты первыми запускают иммунный ответ при острых инфекциях (сальмонеллез, туляремия, листериоз, токсоплазмоз). Внедрение возбудителей активирует γδТ-клетки, что сопровождается продукцией цитокинов: ИФН-γ при Listeria monocytogenes и ИЛ-4 при Nippostrongylus brasiliensis. На экспериментальных моделях инфекционных и аутоиммунных заболеваний было показано, что γδТ-клетки являются основными продуцентами ИЛ-17 [28], который инициирует воспалительные реакции, стимулируя созревание и рекрутирование нейтрофилов из костного мозга [29]. Кроме того, на ранних стадиях рассеянного склероза также описано повышенное содержание γδТ-клеток (до 20–30% общего количества Т-клеток) [30].

В 1994 г. U. Fiszer и соавт. впервые показали, что у пациентов с БП содержание γδТ-лимфоцитов как в периферической крови, так и в ликворе было выше, чем у пациентов с другими неврологическими заболеваниями [31]. Стимулом к изучению субпопуляций Т-лимфоцитов при БП послужили исследования, определившие важный вклад системного воспаления в патогенез БП.

Среди возможных «регуляторов» системного воспаления при БП кишечная микробиота в последние годы стала одним из самых популярных объектов исследования. Подробное изучение её состава стало возможным благодаря внедрению в практику современных методов лабораторной диагностики. Кишечная микробиота находится в тесном контакте с эпителиальным барьером кишечника, подавляющее число иммунных процессов происходит в барьерных тканях, которые подвергаются постоянной антигенной нагрузке. Эпителиальные клетки экспрессируют рецепторы, взаимодействие которых с микроорганизмами приводит к активации и продукции противомикробных пептидов, синтезу цитокинов, усилению экспрессии на эпителиоцитах корецепторов для клеток иммунной системы. М-клетки эпителиального слоя контролируют перенос через барьер чужеродного материала. Такой контролируемый «трафик» необходим для сигнализации иммунной системе о дисбалансе микробиоты. В подэпителиальной рыхлой соединительной ткани lamina propria (собственная пластинка) диффузно расположены клетки врождённого иммунитета, под эпителием в lamina propria — «изолированные лимфоидные фолликулы» с Т-, В-клеточными зонами и герминативным центром, где присутствуют αβТСR CD4+-Т-хелперы (Th1, Th2, Th17) и продуцирующие ИЛ-10 Т-регуляторные клетки, а также В-лимфоциты. Доставляемый М-клетками в фолликулы антигенный материал запускает адаптивный (специфический) иммунный ответ с участием региональных лимфатических образований (аппендикс, миндалины, пейеровы бляшки и др.), локальный иммунный ответ переходит на системный уровень [32].

Эволюция организма-хозяина проходила совместно с бактериями-комменсалами кишечника с целью реализации симбиотических отношений посредством синтеза и реагирования на некоторые общие медиаторы. Результатом совместной эволюции явилось расширение функций микробиоты: её участие в метаболизме нерасщепляемых углеводов, обеспечении хозяина энергоносителями (АТФ), жирными и желчными кислотами, в синтезе витаминов, конкуренции с патогенными микроорганизмами, предотвращении колонизации ими кишечного тракта хозяина и стимуляции его мукозального иммунитета. Кишечник стал местом синтеза веществ, способных влиять на секрецию гормонов, работу нервной и иммунной систем посредством синтеза нейромедиаторов, метаболитов и жирных кислот.

Для объяснения влияния микробиоты кишечника на физиологию хозяина были предложены три механизма [33]:

  • секреция нейромедиаторов, нейропептидов и метаболитов, которые могут непосредственно стимулировать рецепторы в нейронах кишечной нервной системы, тем самым вызывая и/или модулируя нервные сигналы, непосредственно влияющие на физиологию кишечника, или мигрировать через блуждающий нерв в центральную нервную систему;
  • возможность метаболитов и гормонов, производимых микробиотой в кишечном тракте, диффундировать через стенку кишечника в портальную систему и оказывать влияние дистантно;
  • стимуляция медиаторами, продуцируемыми кишечной микробиотой (короткоцепочечными жирными кислотами), рецепторов, экспрессированных на мембране клеток иммунной системы, — таким образом, микробиота участвует в регуляции иммунного ответа как на локальном, так и на системном уровнях.

Ранее с использованием метода газовой хроматографии, совмещённого с масс-спектрометрией, нами было показано, что у пациентов с развёрнутой стадией БП в пристеночном слое кишечника отмечается увеличение общего количества микробных маркеров на 43% по сравнению с группой контроля [34]. Увеличение происходило за счет двукратного повышения количества маркеров условно-патогенной микрофлоры, что сопровождалось снижением вдвое количества микробных маркеров полезной микрофлоры.

В случае развития клинически значимых запоров у пациентов с БП количество бактерий в кишечнике увеличивается, приводя к развитию синдрома избыточного бактериального роста. Показано, что этот синдром коррелирует с тяжестью двигательных расстройств, нарушениями ходьбы, застываниями и выраженностью моторных флуктуаций [35]. Полученные корреляции, в первую очередь, объясняются снижением биодоступности (поступления из кишечника в кровь) противопаркинсонических препаратов на фоне синдрома избыточного бактериального роста [36]. Данная теория подтверждается результатами исследований, проведённых V. Maini Rekdal и соавт. [37]. Ими была продемонстрирована способность Enterococcus faecalis декарбоксилировать леводопу до дофамина, а также возможность дальнейшего дегидроксилирования дофамина до тирамина бактерией Eggerthella lenta.

Цель исследования — изучение субпопуляций лимфоцитов, неклассических γδТ-лимфоцитов и продукции цитокинов у пациентов с третьей стадией БП, испытывающих моторные флуктуации.

Материалы и методы

В исследование были включены 20 пациентов (11 мужчин и 9 женщин; средний возраст 69,0 ± 4,5 года) с БП, получающих комбинированную дофаминергическую терапию: препараты леводопы + агонисты дофаминовых рецепторов, средняя эквивалентная доза леводопы составила 730,4 ± 150,6 мг/сут. С учётом предполагаемой роли хронического запора у пациентов с БП в поддержании дисбиотических состояний и хронического воспаления наличие запоров являлось критерием включения пациента в исследование.

Критерии включения:

  • 3 стадия по шкале Хен–Яра;
  • наличие моторных флуктуаций;
  • наличие симптомов хронического запора.

Наличие моторных флуктуаций определяли с помощью краткого опросника для выявления феномена истощения действия дозы леводопы (WOQ-9) [38].

Верификация хронического запора у пациентов с БП проводилась согласно клиническим рекомендациям Российской гастроэнтерологической ассоциации по диагностике и лечению взрослых пациентов с хроническим запором [39].

Группу контроля составили 20 пациентов (8 мужчин и 12 женщин; средний возраст 67,0 ± 2,5 года) с хроническими цереброваскулярными заболеваниями (дисциркуляторная энцефалопатия I и II стадий).

Критерии невключения:

  • верифицированные заболевания крови, желудочно- кишечного тракта, эндокринных органов;
  • больные, имеющие оценку по Монреальской когнитивной шкале менее 26 баллов.

У всех пациентов определяли субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови и уровень цитокинов. Кровь для исследования брали из локтевой вены, в качестве антикоагулянта использовали ЭДТА. Для визуализации субпопуляций лимфоцитов использовали моноклональные антитела: HLADR-FITC, CD4-PE, CD3-ECD, CD56-PC5.5, CD25-PC7, CD8-APC, CD19-APC-AF700, CD45-APC-AF750. В качестве лизирующего раствора использовали VersaLyse. Пробы анализировали на проточном цитофлюориметре «Navios» в многоцветном протоколе (прибор и реактивы «Beckman Coulter»). Популяцию лимфоцитов оценивали как CD45+brightSSdim-клетки. Анализ образцов проводили при наборе 5000 событий в лимфоцитарном регионе.

Субпопуляции B-лимфоцитов выявляли с использованием моноклональных антител CD19-FITC, CD27-PE, CD5-PC5. Пробы анализировали на проточном цитофлюориметре «Cytomics FC 500» в многоцветном протоколе (прибор и реактивы «Beckman Coulter»). Популяцию лимфоцитов оценивали как FSdimSSdim-клетки. Анализ образцов проводили при наборе 5000 событий в лимфоцитарном регионе.

При определении субпопуляций γδT-лимфоцитов использовали моноклональные антитела CD4-FITC, CD8-PE, CD3-ECD, TCRγδ-PC5, CD8-APC, CD45-APC-AF750. После лизиса эритроцитов пробы отмывали центрифугированием в фосфатно-солевом буфере при 1500 об/мин в течение 5 мин. Пробы анализировали на проточном цито-флюориметре «Navios» в многоцветном протоколе (прибор и реактивы «Beckman Coulter»). Популяцию лимфоцитов оценивали как CD45+brightSSdim-клетки. Анализ образцов проводили при наборе 5000 событий в лимфоцитарном регионе. В связи с отсутствием референсных значений для субпопуляций γδT-лимфоцитов оценку изменений проводили путём сравнения двух групп.

Уровни цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО, ИЛ-10 в культуральных средах (спонтанная, индуцированная продукция) и в сыворотке определяли с использованием наборов реагентов для иммуноферментного анализа (АО «Вектор-Бест», Международный сертификат ISO 13485). Чувствительность набора для определения ИЛ-6 не превышает 0,5 пг/мл, для ИЛ-1β, ФНО, ИЛ-10 — 1,0 пг/мл.

Статистическую обработку проводили в программе «Statistica 8.0». Для выявления различий применяли непараметрический критерий Манна–Уитни, для выявления зависимости — коэффициент корреляции Спирмена. Результаты статистического анализа считали значимыми при р < 0,05. Результаты представлены в виде: медиана [1-й квартиль; 3-й квартиль].

Результаты

При исследовании лимфоцитов периферической крови выявлено, что количественные характеристики популяций лимфоцитов, определённых у пациентов с БП и у лиц группы сравнения, не выходили за границы референсного интервала. Однако общее количество зрелых CD3+-Т-лимфоцитов в группе пациентов с БП было значимо ниже, чем в группе сравнения (табл. 1). По количеству CD3+CD4+-Т-хелперов и CD3+CD8+-Т-цитотоксических лимфоцитов группы были сопоставимы. Количество CD3+CD56+-ТNK-клеток в группе пациентов с БП было достоверно ниже, чем в группе сравнения. При этом в группе пациентов с БП количество CD3CD56+-NK-клеток было значимо выше, чем в группе сравнения. Кроме того, в основной группе выявлено значимое повышение количества активированных CD3CD8+-NK-клеток. Общее количество В-лимфоцитов, количество В1-лимфоцитов было сопоставимо в обеих группах, однако у пациентов с БП значимо снижено количество CD19+CD27+-В-клеток памяти.

 

Таблица 1. Результаты иммунофенотипирования лимфоцитов периферической крови, % (Ме [Q1; Q3]) / Table 1. Results of immunophenotyping peripheral blood lymphocytes, % (Ме [Q1; Q3])

Лимфоциты

Lymphocytes

Норма

Normal

БП

PD

Группа сравнения

Comparison group

Критерий Манна–Уитни

Mann—Whitney test

CD3+

52–76

74,0 [60, 0; 77, 0]

80,0 [75, 0; 82, 0]

0,014

CD3+CD56+

0,1–8

4,7 [2, 7; 5, 2]

7,8 [3, 4; 14, 2]

0,038

CD3+CD4+

31–46

45,0 [39, 0; 53, 6]

49,2 [43, 0; 60, 0]

0,274

CD3+CD8+

23–40

24,3 [20, 0; 32, 0]

26,4 [20, 0; 32, 0]

0,722

CD4+CD8+

0,1–1,1

1,5 [0, 7; 3, 7]

1,0 [0, 6; 1, 5]

0,285

CD3CD8+

1,5–6

7,0 [5, 4; 9, 1]

3,5 [2, 3; 4, 1]

0,001

CD3CD56+

9–19

16,4 [13, 2; 21, 6]

8,7 [7, 0; 13, 0]

0,001

CD3+-TCRγδ

2–7

1,8 [1, 2; 3, 5]

1,4 [1, 1; 3, 1]

0,602

CD19+

6–18

7,5 [5, 0; 11, 0]

13,0 [10, 0; 16, 0]

0,194

CD19+CD5+

0–3,5

1,4 [0, 5; 1, 9]

2,5 [1, 7; 3, 3]

0,451

CD19+CD27+

2–7

2,0 [1, 7; 2, 6]

4,7 [3, 1; 6, 3]

0,031

 

При оценке субпопуляций γδТ-лимфоцитов выявлено, что количество Т-хелперов CD4+CD8-TCRγδ было достоверно меньше в группе пациентов с БП, чем в группе сравнения (табл. 2). В отношении остальных субпопуляций Т-лимфоцитов значимых различий между группами не выявлено.

 

Таблица 2. Результаты иммунофенотипирования γδТ-лимфоцитов, % (Ме [Q1; Q3]) / Table 2. Results of immunophenotyping γδТ cells, % (Ме [Q1; Q3])

Показатель

Parameter

БП

PD

Группа сравнения

Comparison group

Критерий Манна–Уитни

Mann—Whitney test

CD4СD8+

25,1 [22, 2; 35, 5]

19,1 [18, 0; 27, 3]

0,250

CD4CD8+СD56+

17,6 [10, 3; 32, 1]

43,4 [21, 9; 50, 8]

0,052

CD4+CD8

13,6 [8, 4; 19, 5]

29,8 [17, 0; 37, 7]

0,016

CD4+CD8CD56+

2,9 [1, 5; 7, 5]

4,2 [1, 5; 10, 9]

0,660

CD4CD8

57,4 [52, 8; 67, 6]

47,9 [37, 2; 58, 7]

0,163

CD4CD8CD56+

23,6 [13, 5; 40, 0]

22,5 [9, 8; 39, 5]

0,827

CD3+CD56+

15,6 [9, 0; 20, 9]

20,2 [13, 6; 33, 8]

0,155

CD3+CD56

78,7 [64, 6; 84, 3]

78,0 [64, 7; 83, 0]

0,743

 

При исследовании уровней цитокинов в группе пациентов с БП обнаружено значимое повышение индуцированной продукции ИЛ-1β, а также высокая спонтанная продукция ИЛ-10 (табл. 3). Уровень медианы индуцированной продукции ИЛ-10 в исследуемой группе не выходил за границы референсных значений, однако следует отметить сильный разброс полученных результатов, что требует отдельного анализа и, возможно, определяет гетерогенность течения БП.

 

Таблица 3. Результаты оценки уровней цитокинов у пациентов с БП, пг/мл (Ме [Q1; Q3]) / Table 3. Results of measuring cytokine levels in patients with PD, pg/ml (Ме [Q1; Q3])

Показатель

Parameter

Норма

Normal

Результаты

Results

ИЛ-1β / IL-1β

  

спонтанная продукция / spontaneous production

0–107

2,3 [1; 8]

индуцированная продукция / induced production

50–1200

1796,0 [491; 3181]

содержание в сыворотке / content in serum

0–11

1,5 [1; 4]

ИЛ-6 / IL-6

  

спонтанная продукция / spontaneous production

30–280

1,0 [1; 1]

индуцированная продукция / induced production

11 450–42 200

11249,5 [8951; 14041]

содержание в сыворотке / content in serum

0–10

1,0 [1; 1]

ФНО / Tumor necrosis factor

  

спонтанная продукция / spontaneous production

7–30

1,0 [1; 4]

индуцированная продукция / induced production

2810–5700

2532,5 [931; 10199]

содержание в сыворотке / content in serum

0–6

8,5 [1; 56]

ИЛ-10 / IL-10

  

спонтанная продукция / spontaneous production

0–23

227,5 [13; 482]

индуцированная продукция / induced production

66–335

241,0 [94; 447]

содержание в сыворотке / content in serum

0–31

2 [1; 5]

 

Корреляционный анализ субпопуляции Т-хелперов CD4+CD8-TCRγδ и цитокинов в группе пациентов с БП продемонстрировал наличие достоверной обратной зависимости этой субпопуляции Т-хелперов с индуцированной продукцией ИЛ-10 и достоверной прямой зависимости с содержанием провоспалительного цитокина ИЛ-1β (табл. 4). Кроме того, была выявлена тенденция к повышению спонтанной продукции ИЛ-10 при снижении Т-хелперов CD4+CD8-TCRγδ.

 

Таблица 4. Результаты корреляционного анализа содержания CD4+CD8-TCRγδ субпопуляции Т-хелперов и ИЛ-1β, ИЛ-10 / Table 4. Results of the correlation analysis between the TCRγδ CD4+CD8 subpopulation numbers and the IL-1β, IL-10 numbers

Показатель

Parameter

CD4+CD8-TCRγδ субпопуляция Т-хелперов

TCRγδ CD4+CD8 subpopulation of T helper cells

r

p

ИЛ-1β

IL-1β

0,648

0,042

ИЛ-10, индуцированная продукция

IL-10, induced production

–0,745

0,048

ИЛ-10, спонтанная продукция

IL-10, spontaneous production

–0,602

0,0506

 

Обсуждение

Среди отечественных трудов, посвящённых изучению субпопуляционного состава лимфоцитов и клеток врождённого иммунитета у пациентов с БП, представляют интерес данные, изложенные Е.В. Бочаровым и соавт. [40]. Ими были выявлены следующие изменения: снижение общего числа Т-лимфоцитов (CD3+), преимущественно за счёт Т-хелперов (CD4+), CD4+/CD8+-иммунорегуляторного индекса, а также снижение В-лимфоцитов (CD20+) и количества лимфоцитов, экспрессирующих HLA-DR (антигены HLA II), что сочеталось с увеличением количества лимфоцитов с экспрессией рецептора к ИЛ-2 (CD25+) и количества клеток, несущих на мембране CD95+ — маркер готовности к апоптозу. Врождённый иммунитет характеризовался увеличением количества макрофагов (CD11b+ и СD18+) и натуральных киллеров (NK16+). Общими изменениями в субпопуляционном составе лимфоцитов крови, выявленными в исследовании цитируемых авторов и в нашей работе, являются снижение Т-лимфоцитов у пациентов с БП, увеличение в крови CD3CD56+-NK-клеток, наличие параметров активности иммунного ответа: увеличение количества лимфоцитов, экспрессирующих маркер ранней активации в CD25+, а в нашей работе — увеличение количества активированных NK-клеток, значимое повышение индуцированной продукции провоспалительного цитокина ИЛ-1β.

Компоненты клеточной стенки и внутреннего содержания комменсалов и патогенов распознаются TLR эпителия и клетками врождённого иммунитета [41], а микробиота непрерывно сигнализирует мукозоассоциированной лимфоидной ткани и поддерживает барьерный иммунитет в состоянии хронической активации. Однако микробиота обладает и иммуносупрессивными/толерогенными свойствами. Bacteroides fragilis при взаимодействии с TLR2 на клетках врождённого иммунитета может блокировать их провоспалительную активность [32]. Микробиота может активировать комменсал-специфические Т-регуляторные клетки, что приводит к продукции ими противовоспалительного цитокина ИЛ-10 [42]. Таким образом, эти процессы обусловлены взаимодействием микробиоты, барьерного эпителия и клеток врождённого и адаптивного иммунитета в сайте воспаления.

C. Zhou и соавт. продемонстрировали снижение в крови пациентов с более тяжёлым течением БП (по шкале UPDRS) количества TNK и γδT-лимфоцитов в сравнении с этими показателями у здоровых лиц [43]. В нашем исследовании количество CD4+CD8-TCRγδ в периферической крови было достоверно меньше в группе пациентов с БП и сочеталось с аберрантной спонтанной продукцией ИЛ-10. Спонтанная продукция цитокинов γδT-лимфоцитами участвует в поддержании баланса между воспалением и толерантностью [14]. Известно, что основными продуцентами ИЛ-10 являются Т-регуляторные клетки с TCR, представленным αβ- или γδ-цепями, а также В-регуляторные клетки. Вероятно, выраженная спонтанная продукция ИЛ-10 у пациентов с БП связана в том числе с повышенной активностью CD4+CD8-TCRγδ клеток, а именно с регуляторной субпопуляцией.

Известны работы, в которых показано, что количество Т-лимфоцитов меняется в процессе прогрессирования нейродегенерации при БП. Более того, показана взаимосвязь уровня так называемых α-синуклеин-реактивных Т-лимфоцитов со стадией заболевания, возрастом пациента, а также дозой леводопы [44]. α-Синуклеин-реактивные Т-лимфоциты появляются на премоторной стадии БП, достигают максимума на этапе развития моторных симптомов и значительно снижаются на развёрнутых стадиях. Нельзя исключать, что уровень γδT-клеток также меняется в процессе прогрессирования БП, а принимая во внимание роль данных клеток в антибактериальной защите, можно предположить, что эти изменения могут быть связаны и с составом микробиоты.

Таким образом, полученные нами данные позволяют по-новому оценить вклад γδT-клеток в патогенез БП, указывают на их роль в прогрессировании заболевания, а также на взаимосвязь с изменениями (качественными и количественными) кишечной микробиоты при этой патологии.

×

About the authors

Igor V. Krasakov

A.M. Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine; S.M. Kirov Military Medical Academy

Author for correspondence.
Email: annaly-nevrologii@neurology.ru
ORCID iD: 0000-0001-6092-0659

Cand. Sci. (Med.), Head, Center of Extrapyramidal Disorders, assistant, Department of nervous diseases

Russian Federation, St. Petersburg; St. Petersburg

Nataliya I. Davydova

A.M. Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine

Email: annaly-nevrologii@neurology.ru
ORCID iD: 0000-0001-8644-905X

Cand. Sci. (Med.), senior researcher, Head, Clinical immunology laboratory

Russian Federation, St. Petersburg

Anastasiya A. Kalashnikova

A.M. Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine

Email: annaly-nevrologii@neurology.ru
ORCID iD: 0000-0002-5338-0866

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Clinical immunology laboratory

Russian Federation, St. Petersburg

Igor V. Litvinenko

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: annaly-nevrologii@neurology.ru
ORCID iD: 0000-0001-8988-3011

D. Sci. (Med.), Prof., Head, Department of nervous diseases

Russian Federation, St. Petersburg

Sergey S. Aleksanin

A.M. Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine

Email: annaly-nevrologii@neurology.ru
ORCID iD: 0000-0001-6998-1669

D. Sci. (Med.), Prof., Director

Russian Federation, St. Petersburg

Nataliya V. Makarova

A.M. Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine

Email: annaly-nevrologii@neurology.ru
ORCID iD: 0000-0002-8697-0096

Cand. Sci. (Phys. and Math.), leading researcher, Head, Statistical analysis department, Medical Register, EMERCOM of Russia research laboratory of statistical analysis and forecasting

Russian Federation, St. Petersburg

References

  1. Litvinenko I.V., Krasakov I.V., Bisaga G.N. et al. Modern conception of the pathogenesis of neurodegenerative diseases and therapeutic strategy. Zh Nevrol Psikhiatr Im S S Korsakova. 2017;6-2:3–10. doi: 10.17116/jnevro2017117623-10. PMID: 28980606. (In Russ.)
  2. Członkowska A., Kurkowska-Jastrzebska I., Członkowski A. et al. Immune processes in the pathogenesis of Parkinson’s disease — a potential role for microglia and nitric oxide. Med Sci Monit. 2002;8(8):RA165–RA177. PMID: 12165754.
  3. Whitton P.S. Inflammation as a causative factor in the aetiology of Parkinson’s disease. Br J Pharmacol. 2007;150(8):963–976. doi: 10.1038/sj.bjp.0707167. PMID: 17339843.
  4. Chen Z., Chen S., Liu J. The role of T cells in the pathogenesis of Parkinson’s disease. Prog Neurobiol. 2018;169:1–23. doi: 10.1016/j.pneurobio.2018.08.002. PMID: 30114440.
  5. Yarilin A.A. [Immunologiya]. Moscow: GEOTAR-Media; 2010. (In Russ.)
  6. Janeway C.A. Jr., Travers P., Walport M., Shlomchik M.J. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. New York: Garland Science, 2001.
  7. Nizhegorodova D.B., Zafranskaya M.M. γδТ-Lymphocytes: general characteristics, subpopulation profile, biological role, and fuctional features. Meditsinskaya immunologiya. 2009;11(2–3):115–130. doi: 10.15789/1563-0625-2009-2-3-115-130. (In Russ.)
  8. Hedges J.F., Jutila M.A. Harnessing γδ T cells as natural immune modulators. Mucosal Vaccines. 2020;773–787. doi: 10.1016/B978-0-12-811924-2.00046-8.
  9. Saito H., Kranz D.M., Takagaki Y. et al. Complete primary structure of a heterodimeric T-cell receptor deduced from cDNA sequences. Nature. 1984;309(5971):757–62. doi: 10.1038/309757a0. PMID: 6330561.
  10. Chien Y.H., Iwashima M., Kaplan K.B. et al. A new T-cell receptor gene located within the alpha locus and expressed early in T-cell differentiation. Nature. 1987;327(6124):677–682. doi: 10.1038/327677a0. PMID: 2439914.
  11. Groh V., Porcelli S., Fabbi M. et al. Human lymphocytes bearing T cell receptor gamma/delta are phenotypically diverse and evenly distributed throughout the lymphoid system. J Exp Med. 1989;169(4):1277–1294. doi: 10.1084/jem.169.4.1277. PMID: 2564416.
  12. Parker C.M., Groh V., Band H. et al. Evidence for extrathymic changes in the T cell receptor gamma/delta repertoire. J Exp Med. 1990;171(5):1597–1612. doi: 10.1084/jem.171.5.1597. PMID: 2185330.
  13. McCarthy N.E., Hedin C.R., Sanders T.J. Azathioprine therapy selectively ablates human Vδ2+ T cells in Crohn’s disease. J Clin Invest. 2015;125(8):3215–3225. doi: 10.1172/JCI80840. PMID: 26168223.
  14. Paul S., Singh A.K., Lal S., Lal G. Phenotypic and functional plasticity of gamma-delta (γδ) T cells in inflammation and tolerance. Int Rev Immunol. 2014;33(6):537–558. doi: 10.3109/08830185.2013.863306. PMID: 24354324.
  15. Harly C., Guillaume Y., Nedellec S. Key implication of CD277/butyrophilin-3 (BTN3A) in cellular stress sensing by a major human γδ T-cell subset. Blood. 2012;120(11):2269–2279. doi: 10.1182/blood-2012-05-430470. PMID: 22767497.
  16. Moore K.W., de Waal Malefyt R., Coffman R.L., O’Garra A. Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor. Annu Rev Immunol. 2001;19:683–765. doi: 10.1146/annurev.immunol.19.1.683. PMID: 11244051.
  17. Saraiva M., O’Garra A. The regulation of IL-10 production by immune cells. Nat Rev Immunol. 2010;10(3):170–181. doi: 10.1038/nri2711. PMID: 20154735.
  18. Gutierrez J., Raju S., Riley J.P., Boulis N.M. Introduction to neuropathic pain syndromes. Neurosurg Clin N Am. 2014;25(4):639–662. DOI: 10.1016/ j.nec.2014.06.002. PMID: 25240654.
  19. Tarazi F.I., Sahli Z.T., Wolny M., Mousa S.A. Emerging therapies for Parkinson’s disease: from bench to bedside. Pharmacol Ther. 2014;144(2):123–133. doi: 10.1016/j.pharmthera.2014.05.010. PMID: 24854598.
  20. Naundorf S., Schröder M., Höflich C. et al. IL-10 interferes directly with TCR-induced IFN-gamma but not IL-17 production in memory T cells. Eur J Immunol. 2009;39(4):1066–1077. doi: 10.1002/eji.200838773. PMID: 19266486.
  21. Sabat R., Grütz G., Warszawska K. Biology of interleukin-10. Cytokine Growth Factor Rev. 2010;21(5):331–344. doi: 10.1016/j.cytogfr.2010.09.002. PMID: 21115385.
  22. Moore T.A., Moore B.B., Newstead M.W., Standiford T.J. Gamma delta-T cells are critical for survival and early proinflammatory cytokine gene expression during murine Klebsiella pneumonia. J Immunol. 2000;165(5):2643–2650. doi: 10.4049/jimmunol.165.5.2643. PMID: 10946293.
  23. Toth B., Alexander M., Daniel T. et al. The role of gammadelta T cells in the regulation of neutrophil-mediated tissue damage after thermal injury. J Leukoc Biol. 2004;76(3):545–552. doi: 10.1189/jlb.0404219. PMID: 15197233.
  24. Koohsari H., Tamaoka M., Campbell H.R., Martin J.G. The role of gamma delta T cells in airway epithelial injury and bronchial responsiveness after chlorine gas exposure in mice. Respir Res. 2007;8(1):21. doi: 10.1186/1465-9921-8-21. PMID: 17343743.
  25. Balbi B., Valle M.T., Oddera S. et al. T-lymphocytes with gamma delta+ V delta 2+ antigen receptors are present in increased proportions in a fraction of patients with tuberculosis or with sarcoidosis. Am Rev Respir Dis. 1993;148 (6 Pt 1):1685–1690. doi: 10.1164/ajrccm/148.6_Pt_1.1685. PMID: 8256920.
  26. Bertotto A., Gerli R., Spinozzi F. et al. Lymphocytes bearing the gamma delta T cell receptor in acute Brucella melitensis infection. Eur J Immunol. 1993;23(5):1177–1180. doi: 10.1002/eji.1830230531. PMID: 8477812.
  27. Caldwell C.W., Everett E.D., McDonald G. et al. Apoptosis of gamma/delta T cells in human ehrlichiosis. Am J Clin Pathol. 1996;105(5):640–646. doi: 10.1093/ajcp/105.5.640. PMID: 8623774.
  28. Chien Y.H., Meyer C., Bonneville M. γδ T cells: first line of defense and beyond. Annu Rev Immunol. 2014;32:121–155. doi: 10.1146/annurev-immunol-032713-120216. PMID: 24387714.
  29. Stark M.A., Huo Y., Burcin T.L. et al. Phagocytosis of apoptotic neutrophils regulates granulopoiesis via IL-23 and IL-17. Immunity. 2005;22(3):285–294. doi: 10.1016/j.immuni.2005.01.011. PMID: 15780986.
  30. Wucherpfennig K.W., Newcombe J., Li H. et al. Gamma delta T-cell receptor repertoire in acute multiple sclerosis lesions. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89(10):4588–4592. doi: 10.1073/pnas.89.10.4588. PMID: 1374907.
  31. Fiszer U., Mix E., Fredrikson S. et al. Gamma delta+ T cells are increased in patients with Parkinson’s disease. J Neurol Sci. 1994;121(1):39–45. doi: 10.1016/0022-510x(94)90154-6. PMID: 8133310.
  32. Kozlov I.G. [Microbiota, mucosal immunity and antibiotics: the fineness of the interaction]. RMJ. 2018;8(1):19–27. (In Russ.)
  33. Campos-Acuña J., Elgueta D., Pacheco R. T-cell-driven inflammation as a mediator of the gut-brain axis involved in Parkinson’s disease. Front Immunol. 2019;10:239. doi: 10.3389/fimmu.2019.00239. PMID: 30828335.
  34. Krasakov I.V., Litvinenko I.V. , Rodionov G.G. et al. Evaluation of gut microbiota in Parkinson’s disease using gas chromatography with mass spectrometric detection. Annals of clinical and experimental neurology. 2018;12(4):23–29. doi: 10.25692/ACEN.2018.4.3. (In Russ.)
  35. Fasano A., Bove F., Gabrielli M. et al. The role of small intestinal bacterial overgrowth in Parkinson’s disease. Mov Disord. 2013;28(9):1241–1249. doi: 10.1002/mds.25522. PMID: 23712625.
  36. Fasano A., Visanji N.P., Liu L.W. et al. Gastrointestinal dysfunction in Parkinson’s disease. Lancet Neurol. 2015;14(6):625–639. doi: 10.1016/S1474-4422(15)00007-1. PMID: 25987282.
  37. Maini Rekdal V., Bess E.N., Bisanz J.E. et al. Discovery and inhibition of an interspecies gut bacterial pathway for Levodopa metabolism. Science. 2019;364(6445):eaau6323. doi: 10.1126/science.aau6323. PMID: 31196984.
  38. Stacy M., Bowron A., Guttman M. et al. Identification of motor and nonmotor wearing-off in Parkinson’s disease: comparison of a patient questionnaire versus a clinician assessment. Mov Disord. 2005;20(6):726–733. doi: 10.1002/mds.20383. PMID: 15719426.
  39. Ivashkin V.T., Mayev I.V., Sheptulin A.A. Diagnostics and treatment of chronic constipation in adults: clinical guidelines of the Russian gastroenterological association. Russian Journal of Gastroenterology, Hepatology, Coloproctology. 2017;27(3):75–83. doi: 10.22416/1382-4376-2017-27-3-75-83. (In Russ.)
  40. Bocharov E.V., Kryzhanovsky G.N., Poleschuk V.V. Immune and antioxidant disorders in Parkinson’s disease. Patogenez. 2012;10(1):34–38. (In Russ.)
  41. Bouskra D., Brézillon C., Bérard M. et al. Lymphoid tissue genesis induced by commensals through NOD1 regulates intestinal homeostasis. Nature. 2008;456(7221):507–510. doi: 10.1038/nature07450. PMID: 18987631.
  42. Ubeda C., Pamer E.G. Antibiotics, microbiota, and immune defense. Trends Immunol. 2012;33(9):459–466. doi: 10.1016/j.it.2012.05.003. PMID: 22677185.
  43. Zhou C., Zhou X., He D. et al. Reduction of peripheral blood iNKT and γδT cells in patients with Parkinson’s disease: an observational study. Front Immunol. 2020;11:1329. doi: 10.3389/fimmu.2020.01329. PMID: 32670293.
  44. Lindestam Arlehamn C.S., Dhanwani R., Pham J. et al. α-Synuclein-specific T cell reactivity is associated with preclinical and early Parkinson’s disease. Nat Commun. 2020;11(1):1875. doi: 10.1038/s41467-020-15626-w. PMID: 32313102.

Statistics

Views

Abstract: 258

PDF (Russian): 87

Article Metrics

Metrics Loading ...

Dimensions

PlumX


Copyright (c) 2022 Krasakov I.V., Davydova N.I., Kalashnikova A.A., Litvinenko I.V., Aleksanin S.S., Makarova N.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies