A method of inhibiting the ABCB1 protein in the blood-brain barrier  in vivo

Ivan V. Chernykh; Черных Иван Владимирович; Alexey V. Shchulkin; Щулькин Алексей Владимирович; Pavel Yu. Mylnikov; Мыльников Павел Юрьевич; Ekaterina E. Kirichenko; Кириченко Екатерина Евгеньевна; Maria V. Gatsanoga; Гацанога Мария Валерьевна; Elena N. Yakusheva; Якушева Елена Николаевна

doi:10.54101/ACEN.2022.3.6

A method of inhibiting the ABCB1 protein in the blood-brain barrier in vivo

Authors: Chernykh I.V.¹, Shchulkin A.V.¹, Mylnikov P.Y.¹, Kirichenko E.E.¹, Gatsanoga M.V.¹, Yakusheva E.N.¹
Affiliations:
1. Ryazan State Medical University
Issue: Vol 16, No 3 (2022)
Pages: 47-52
Section: Original articles
Submitted: 26.11.2021
Accepted: 14.02.2022
Published: 10.10.2022
URL: https://annaly-nevrologii.com/journal/pathID/article/view/788
DOI: https://doi.org/10.54101/ACEN.2022.3.6
ID: 788

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Introduction. Increased functional activity of the P-glycoprotein transporter (ABCB1) in the blood-brain barrier (BBB) is a possible reason why neuroprotective pharmacotherapy is ineffective after ischaemic stroke.

Study aim — to develop a way to inhibit the functional activity of ABCB1 at the BBB.

Materials and methods. The study was performed on 60 male Wistar rats weighing 200-280 g. The functional activity of ABCB1 at the BBB was assessed by measuring the plasma and cortical levels of the marker transporter substrate fexofenadine (intravenous administration of 10 mg/kg). Thirty minutes before the administration of fexofenadine, 1 ml/kg of intravenous saline (n = 30) or 17.6 mg/kg of omeprazole, the transporter's systemic inhibitor (n = 30), was administered to the rats. The total amount of fexofenadine in the systemic circulation and the cerebral cortex was assessed using high performance liquid chromatography, by calculating the area under the blood concentration–time curve (AUC0-t(plasma)) or the cerebral cortex concentration (AUC0-t(brain)). BBB permeability was calculated using the ratio AUC0-t(brain)/AUC0-t(plasma).

Results. The administration of omeprazole before fexofenadine did not affect the plasma level of the latter at any time point under analysis. Fexofenadine’s AUC0-t(plasma) also did not differ between the series. However, the administration of omeprazole increased the cortical level of fexofenadine by 2.96 times (p = 0.009), 5 minutes after administration of the latter, and increased the AUC0-t(brain) by 1.49 times (p = 0.012). AUC0-t(brain)/AUC0-t(plasma) increased by 1.71 times when omeprazole was used (p = 0.003). Therefore, omeprazole inhibits the functional activity of ABCB1 at the BBB.

Conclusions. We developed and tested a method for inhibiting ABCB1 activity at the BBB.

Keywords

glycoprotein-P, ABCB1 protein, functional activity, blood-brain barrier, omeprazole, neuroprotection

Full Text

Введение

Гликопротеин P (белок ABCB1) — продукт гена MDR1 (Multidrug resistance gene 1), который представляет собой эффлюксный мембранный АТФ-зависимый низкоспецифичный белок-транспортёр с широкой локализацией в организме. Функционируя в гематоэнцефалическом барьере (ГЭБ), ABCB1 препятствует проникновению в ткани головного мозга лекарственных веществ, принадлежащих к числу его субстратов [1].

Функциональная активность ABCB1 зависит от генотипа [2], пола [3], изменяется на фоне введения лекарственных средств [4], при развитии ряда патологических процессов [5]. Повышение активности белка-транспортёра в ГЭБ связывают с развитием лекарственно-резистентной эпилепсии и болезни Альцгеймера [6, 7]. Кроме того, было обнаружено, что ABCB1 контролирует фармакокинетику ряда лекарственных препаратов с доказанной нейропротективной активностью: нимодипина [8], флавоноидов [9] и др. Несмотря на противоречивые результаты исследований по влиянию гипоксии различных видов на функционирование ABCB1 [5, 10–12], большинство учёных сходятся во мнении, что эффлюксная активность и экспрессия ABCB1 на фоне кислородного дефицита возрастает. В нашем предварительном исследовании также продемонстрировано возрастание абсолютного количества транспортёра на фоне перманентной билатеральной окклюзии общих сонных артерий крыс [13]. В этой связи недостаточное проникновение нейропротекторов через ГЭБ из-за их эффлюкса ABCB1, активность которого повышена при ишемическом инсульте, может являться причиной неэффективности нейропротекторной терапии [14].

Ингибирование транспортёра в ГЭБ на фоне церебральной ишемии может являться обнадеживающей стратегией для повышения эффективности нейропротекторной коррекции её последствий. С другой стороны, снижение активности ABCB1 на уровне целостного организма связано со значительным числом фармакокинетических и фармакодинамических ограничений в связи с его важной ролью в снижении энтеральной абсорбции и контроле экскреции лекарственных веществ-субстратов [15]. За последние десятилетия были созданы три поколения системных ингибиторов ABCB1 [16]. Соединения первого поколения (антигипертензивное средство верапамил) применялись в клинической практике, и в дополнение к основной фармакологической активности для них был выявлен ингибирую- щий потенциал по отношению к ABCB1. Их химическая модификация с целью минимизировать специфическую активность, но сохранить способность снижать активность транспортёра, привела к созданию препаратов второго поколения. Средство третьего поколения тариквидар было создано путём целенаправленного синтеза с учётом особенностей химического строения ранее известных ингибиторов ABCB1. Ни одно из имеющихся на сегодня веществ — ингибиторов транспортёра не является безопасным вследствие, в частности, повышения риска системных межлекарственных взаимодействий [17]. Ряд препаратов предложен в качестве ингибиторов ABCB1 в эндотелиальных клетках ГЭБ in vitro: например, производные тиосемикарбазона [18], антипсихотический препарат пероспирон [19], алкилирующий агент темозоломид [20]. Показано, что внутривенная инфузия тариквидара здоровым добровольцам приводила к тотальному ингибированию ABCB1 в ГЭБ [21]. Частичное ингибирование транспортёра в ГЭБ достигалось введением добровольцам хинидина [22]. Однако тариквидар и хинидин снижают также системную активность транспортёра, что чревато непредсказуемым изменением фармакокинетики его субстратов. Селективных и безопасных ингибиторов активности ABCB1 in vivo в ГЭБ на сегодняшний день не предложено.

Целью исследования явилась разработка метода ингибирования функциональной активности ABCB1 в ГЭБ in vivo.

Материалы и методы

Исследование выполнено на 60 половозрелых крысах-самцах Вистар массой 200–280 г в соответствии с правилами лабораторной практики¹. Исследование было одобрено комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России (протокол № 7 от 03.04.2018).

Функциональную активность ABCB1 в ГЭБ животных анализировали на фоне внутривенного введения изотонического раствора (1 мл/кг) (группа контроля; n = 30) и на фоне инъекции блокатора протонной помпы омепразола («Dr. Reddy’s») в дозе 17,6 мг/кг (n = 30) по содержанию маркерного субстрата транспортёра — фексофенадина (ФФ) в плазме крови и коре головного мозга животных после его однократного внутривенного введения в дозе 10 мг/кг. Доза омепразола была выбрана на основе данных научной литературы о концентрации полумаксимального ингибирования (IC50) по отношению к ABCB1 in vitro [23–26]. Кора головного мозга была выбрана для исключения возможности забора на анализ подкорковых структур, не ограниченных от крови ГЭБ. Лекарственная форма ФФ для парентерального введения отсутствует, в связи с этим проводилась экстракция целевого вещества из таблеток («Sanofi Aventis») ацетонитрилом с последующим упариванием органического растворителя на роторно-вакуумном испарителе при 50ºС, растворением сухого остатка в воде для инъекций и подтверждением концентрации раствора методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с детектированием в ультрафиолетовом (УФ) свете и фильтрованием через бактериальный фильтр («Corning») с диаметром пор 0,22 мкм. Концентрация водного раствора ФФ составила 10 мг/мл.

У крыс через 5, 10, 15, 30, 45 и 60 мин после внутривенного введения ФФ под глубоким наркозом из брюшной аорты забирали 4 мл крови, а также образец лобной доли коры головного мозга после транскардиальной перфузии 100 мл изотонического раствора для удаления интраваскулярного вещества. На каждую временную точку в обеих группах приходилось по 5 животных [27].

Для выделения ФФ к 1,5 мл плазмы крови крыс прибавляли 4 мл ацетонитрила, встряхивали при 400 об/мин 15 мин, центрифугировали при 1750g 15 мин и упаривали супернатант при 50ºС. Сухой остаток растворяли в 200 мкл подвижной фазы и 100 мкл вводили в хроматограф для анализа. Коэффициент извлечения ФФ из плазмы составил 83,6%. Для извлечения целевого вещества из головного мозга образцы ткани массой 0,5 г гомогенизировали в 500 мкл деионизированной воды в течение 1 мин, после чего белок осаждался 4 мл ацетонитрила путём встряхивания на приборе «Vortex» в течение 15 мин с последующим центрифугированием 15 мин при 1750g и забором надосадочного слоя, который упаривали при 50ºС на роторно-вакуумном испарителе. Далее сухой остаток растворяли в 200 мкл подвижной фазы и 100 мкл вводили в хроматограф. Степень извлечения целевого вещества составляла 81,3%.

Количественный анализ ФФ проводили по оригинальным валидированным ВЭЖХ-методикам с использованием хроматографической системы «Stayer» с УФ-детектирова-нием при длине волны 220 нм в изократическом режиме. Применялась хроматографическая колонка «Phenomenex Synergi 4u Polar-RP 80A» (250 × 4,6) с зернением 4 мкм. Температура разделения — 45ºС. Скорость потока подвижной фазы — 1,0 мл/мин. Состав подвижной фазы: вода деионизированная — ацетонитрил — ледяная уксусная кислота (50–50–0,1), pH 5,5. Время удерживания ФФ в указанных условиях в обеих тканях составило 14,91 ± 0,25 мин.

Количественный анализ ФФ в обеих тканях проводился методом абсолютной калибровки по площади пиков. Рабочий диапазон концентраций ФФ для плазмы крови составлял 0,1–17,0 мкг/мл, для гомогената мозга — 0,05–2,0 мкг/г, линейность методик соответствовала установленным нормам (коэффициент корреляции составлял более 0,99), ошибка метода не превышала 15%. Нижний предел обнаружения вещества в плазме крови составил 12 нг/мл, предел количественного определения — 100 нг/мл. В гомогенате мозга данные показатели составляли 35 и 50 нг/г соответственно. Верхний предел количественного определения для обеих методик соответствовал максимальной точке калибровочной кривой.

Общее количество ФФ в системном кровотоке и в коре больших полушарий оценивали по площади под кривой концентрация ФФ (в крови или ткани коры больших полушарий головного мозга)–время (AUC_{0-t(плазма)} или AUC_{0-t(мозг)}), которые рассчитывали методом трапеций. Для оценки проницаемости ГЭБ был рассчитан показатель AUC_{0-t(мозг)}/AUC_{0-t(плазма)} [27].

Результаты исследования обрабатывали с помощью программы «Statistica v.13.0» («StatSoft Inc.»). Характер распределения данных оценивали по критерию Шапиро–Уилка, далее использовали тест ANOVA и критерий Ньюмена–Кейлса. Различия считали достоверными при уровне значимости p < 0,05 [27].

Результаты

Концентрация ФФ в плазме крови крыс через 5 мин после его внутривенного введения в дозе 10 мг/кг массы на фоне введения изотонического раствора (контроль) составила более 16 мкг/мл, затем постепенно снижалась и достигала минимума (1,0 мкг/мл) к 60 мин исследования (рис. 1). Введение омепразола существенно не влияло на концентрацию ФФ в плазме крови крыс ни в одну из анализируе-мых временных точек. AUC0-t(плазма) ФФ также не различалась в указанных сериях.

Рис. 1. Динамика концентраций ФФ в плазме крови после его внутривенного введения в дозе 10 мг/кг массы контрольным крысам и животным на фоне введения омепразола (17,6 мг/кг внутривенно). / Fig. 1. Changes in the plasma fexofenadine level after intravenous administration of 10 mg/kg of fexofenadine to rats in the control group and in the group that received omeprazole (17.6 mg/kg intravenously).

Следует отметить, что внутривенное введение животным маркерного субстрата ABCB1 позволяет выявить изменение активности транспортёра только в печени и почках (органах, ответственных за экскрецию ФФ), но не в слизистой оболочке тонкого кишечника.

ФФ в коре больших полушарий головного мозга контрольных крыс детектировался уже через 5 мин после его внутривенного введения в дозе 10 мг/кг массы: его концентрация составляла 320,93 ± 140,01 нг/г, достигала своего максимума (399,9 ± 156,5 нг/г) через 15 мин и постепенно снижалась к 60 мин исследования до 166,2 ± 31,7 нг/г (рис. 2).

Рис. 2. Динамика концентраций ФФ в гомогенате коры головного мозга после его внутривенного введения в дозе 10 мг/кг массы контрольным крысам и животным на фоне введения омепразола (17,6 мг/кг внутривенно). / Fig. 2 Changes in the cortical fexofenadine level after intravenous admi- nistration of 10 mg/kg of fexofenadine to rats in the control group and in the group that received omeprazole (17.6 mg/kg intravenously).

Применение омепразола повышало концентрацию ФФ в коре больших полушарий через 5 мин после введения последнего в 2,96 раза (p = 0,009) по сравнению с показателями крыс, которым вводили ФФ после изотонического раствора.

Дополнительно была рассчитана AUC0-t(мозг) ФФ, которая характеризует общее количество ФФ, поступившее в кору мозга после введения омепразола (таблица). Установлено, что введение омепразола увеличивало данный показатель в 1,49 раза (p = 0,012).

Усредненные значения AUC ФФ в гомогенате головного мозга и плазме крови крыс, а также соотношение указанных параметров у контрольных крыс и животных на фоне введения 17,6 мг/кг омепразола (M ± m) / Mean fexofenadine AUC values in the cortical homogenate and blood plasma of the rats, as well as comparison of these parameters in the control rats and in animals that received omeprazole 17.6 mg/kg (M ± m)

Серия эксперимента

Experimental series

AUC_{0-t(плазма)}, мкг/(мл × мин)

AUC_{0-t (plasma)}, μg/(ml × min)

AUC_{0-t(мозг)}, мкг/(г × мин)

AUC_{0-t (brain)}, μg/(g × min)

AUC_{0-t(мозг)}/AUC_{0-t(плазма)}

AUC_0-t(brain)/AUC_0-t(plasma)

Контроль

Control

186,82 ± 66,41

16,20 ± 3,73

0,087 ± 0,046

Омепразол

Omeprazole

162,29 ± 53,12

24,11 ± 4,26*

0,149 ± 0,039*

Примечание. * – достоверные различия с группой контроля; данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартное отклонение.

Note. * – statistically significant difference compared with the control group; values are given as the arithmetic mean ± standard deviation.

В связи с тем, что возрастание параметра AUC0-t(мозг) может быть следствием как снижения функциональной активности ABCB1 локально в ГЭБ, так и проявляться благодаря увеличению плазменной концентрации маркерного субстрата транспортёра, целесообразно было оценить отношение AUC0-t(мозг)/AUC0-t(плазма), изменение которого характеризует только активность Р-гликопротеина в ГЭБ.

Указанный показатель достоверно возрастал при применении ингибитора активности транспортёра — омепразола в 1,71 раза (p = 0,003).

Таким образом, омепразол в дозе 17,6 мг/кг снижает функциональную активность ABCB1 локально в ГЭБ без существенного изменения системной активности транспортёра.

Обсуждение

Одной из вероятных причин неэффективности нейропротективных лекарственных средств при коррекции последствий ишемических поражений мозга является их недостаточное проникновение через ГЭБ за счёт эффлюкса ABCB1, активность которого, как было показано ранее, повышается на фоне дефицита кислорода, неизбежного при данной нозологии. Подтверждением данному предположению является принадлежность ряда лекарственных средств указанной группы к числу субстратов транспортёра. Например, при пероральном введении крысам блокатора кальциевых каналов нимодипина совместно с ингибитором ABCB1 правастатином относительная биодоступность первого возрастала в 1,12–1,31 раза относительно контроля, что свидетельствует об участии данного транспортёра в регуляции его энтеральной абсорбции [28]. Подобные исследования по проникновению данного вещества в головной мозг отсутствуют, однако, вследствие локализации транспортёра в ГЭБ [29], следует предполагать его участие в контроле данного процесса.

Препарат цилнидепин, обладающий антигипертензивной и нейропротективной активностью, также показал свою принадлежность к субстратам ABCB1 на культуре эпителиальных клеток почек свиньи (LLC-GA5-COL150 cells), гиперэкспрессирующих белок-транспортёр, и на мышах, нокаутированных по гену MDR1, кодирующему ABCB1 [30].

Кроме того, большое число лекарственных средств с выявленной нейропротективной активностью (статины [31], ряд флавоноидов [9], антихолинэстеразное средство ривастигмин [7], берберин [32]) не применяются в качестве таковых в связи с тем, что в терапевтической дозе за счёт эффлюкса из головного мозга ABCB1 не достигают нейропротективной концентрации, а при повышении дозы оказывают выраженные системные побочные эффекты.

В нашем исследовании апробировался способ целенаправленного снижения функциональной активности ABCB1 локально в ГЭБ. В качестве тест-системы для анализа функционирования транспортёра использовались крысы в связи с продемонстрированным 93% сходством спектра субстратов и модуляторов его активности с таковыми у людей [33].

Лекарственным средством с потенциальной ингибирующей активностью по отношению к ABCB1 был выбран блокатор протонной помпы омепразол. Препараты — представители данной фармакологической группы (омепразол, пантопразол, лансопразол) показали ингибирующую активность по отношению к транспортёру на культурах клеток Caco-2 и L-MDRI с IC50 17,7, 17,9 и 62,8 мкМ соответственно, что выявлено по степени транслокации субстрата транспортёра — дигоксина [23, 24].

Эти данные принимались в расчёт при подборе дозы омепразола. Так, при внутривенном введении крысам 3,45 мг/кг вещества максимальная концентрация составляет 3,5 мкМ [25]. С учётом линейности фармакокинетики омепразола при его однократном назначении пациентам [26] (для крыс подобная информация в литературе отсутствует), чтобы получить 17,7 мкМ (IC50 по отношению к ABCB1 для омепразола), необходимо ввести 17,6 мг/кг. Указанная доза превышает терапевтические значения для человека, что, однако, не исключает ингибирующего потенциала омепразола по отношению к ABCB1 в клинике в более низких концентрациях (это, естественно, требует проверки).

В качестве маркерного субстрата ABCB1 был использован H1-гистаминолитик третьего поколения — ФФ. Данное вещество обладает низкой токсичностью и отсутствием кумуляции, не метаболизируется в организме, а его фармакокинетика, в том числе проникновение в головной мозг, зависит от функционирования белка-транспортёра ABCB1 [34].

В нашем исследовании однократное внутривенное введение омепразола вызывало снижение функциональной активности ABCB1 локально в ГЭБ, что проявлялось накоплением маркерного субстрата белка-транспортёра — ФФ в коре головного мозга крыс. Обращает на себя внимание то, что на фоне введения омепразола содержание ФФ в коре головного мозга превышает контрольные значения только через 5 мин после введения последнего, в дальнейшем его фармакокинетика весьма схожа в разных экспериментальных сериях. Вероятной причиной этому служит короткий период полувыведения ингибитора при внутривенном введении крысам (менее 0,3 ч) [35] и невозможность оказывать прямое ингибирующее действие на транспортёр в течение всего срока наблюдения. Указанное ограничение препарата возможно компенсировать, например, созданием его пролонгированной парентеральной лекарственной формы.

Полученные нами результаты создают предпосылки для использования омепразола и его дозы в качестве положительного контроля сниженной функциональной активности ABCB1 в ГЭБ при поиске веществ аналогичного действия in vivo, что может служить альтернативой применения нокаутированных по данному транспортёру животных. Кроме того, использование данного подхода возможно при анализе перспективности снижения активности ABCB1 для повышения эффективности фармакотерапии патологий головного мозга, при которых активность транспортёра повышается, например, при церебральной ишемии, опухолях головного мозга или фармакорезистентной эпилепсии. Данная стратегия для увеличения доставки в мозг лекарственных средств в экспериментах успешно развивается зарубежными учёными [36, 37]. После проверки подобной концепции в клинических исследованиях её можно будет рекомендовать к применению в клинической практике.

Выводы

Разработан и апробирован метод ингибирования активности ABCB1 в ГЭБ.

¹ Приказ Министерства здравоохранения РФ от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики».