Changes in contractile characteristics of rat skeletal muscles associated with P2-receptor activation after spinal cord transection

Full Text

Введение

Повреждения и травмы спинного мозга, периферических нервов нередко встречаются среди лиц трудоспособного возраста, могут сопровождаться тяжёлыми и зачастую необратимыми нарушениями двигательной системы. Травматическое повреждение спинного мозга характеризуется немедленной и необратимой потерей ткани в месте повреждения, а также вторичным распространением области поражения ткани с течением времени. Известно, что травма периферического нерва вызывает разно- образные изменения в экспрессии внутриклеточных сигнальных молекул спинного мозга [1], в первую очередь в ответ на повышение уровня высвобождения различных медиаторов в активированной микроглии спинного мозга [2], что может играть важную роль в развитии и поддержании нейропатической боли [3].

Активированная травматическим событием микроглия выделяет и производит провоспалительные цитокины и хемокины [4], которые могут усиливать активность нейронов. Среди медиаторов повреждения особо можно выделить АТФ, которая вовлечена в процессы формирования острой и хронической нейропатической боли [5], и чрезмерное её высвобождение травмированной тканью вызывает активацию высокоаффинных микроглиальных пуринергических рецепторов, что в дальнейшем может повлиять на механизмы вторичного повреждения тканей [3].

При общей изученности эффектов АТФ на периферической нервной системе патофизиологическая роль пуринергического сигнального звена при спинализации не раскрыта. В связи с этим целью работы является оценка динамики сокращений скелетных мышц крысы при воздействии на Р2-рецепторы после спинализации.

Материалы и методы

Для экспериментов использовали лабораторных крыс-самцов линии Вистар в возрасте 9–12 мес, массой 160–240 г. В качестве объекта исследования выступали структуры опорно-двигательного аппарата тазовых конечностей, имеющие принципиальное значение в организации двигательной активности (морфологически различные: медленная активность — камбаловидная мышца (m. soleus), быстрая — длинный разгибатель большого пальца ноги — m. extensor digitorum longus (EDL)), и функционально отличающаяся от них дыхательная мышца — диафрагма (m. diaphragma) — с соответствующими нервно-мышечными синапсами интактных крыс и животных после спинализации.

За 1 нед до начала и во время экспериментов крыс размещали в отдельных клетках при комнатной температуре 22ºС с циклом свет/темнота: 12 ч/12 ч, доступом к воде и пище ad libitum. Все манипуляции осуществляли в одинаковое время суток. Крыс разделили на 2 группы по 12 особей: в группу «норма» вошли интактные животные, в группу «спинализация» — животные, подвергшиеся перерезке спинного мозга.

Операцию производили в асептических условиях под комбинированной внутримышечной анальгезией с использованием золетила («Zoletil 50» «Virbac») 0,5 мг/кг и ксилавета (XylaVET, «Pharmamagist Ltd.») 0,5 мл/кг. После препарирования Th6–Th7 позвонков производили ламинэктомию для оголения позвоночного канала с последующей перерезкой спинного мозга на данном уровне (рис. 1).

 

Рис. 1. Схема спинализации на уровне Th6–Th7.

Fig. 1. Schematic diagram of spinalization at Th6–Th7.

 

Через 7 дней после операции животных наркотизировали раствором этаминала натрия (40 мг/кг внутрибрюшинно), обескровливали и выделяли m. soleus, m. EDL, m. diaphragma с культями нервов, которые фиксировали за оба сухожильных конца, погружали в стаканчики объёмом 10 мл, наполненные раствором Кребса– Хензелайта [6].

Культю нерва выделенной мышцы помещали во «всасывающий» электрод оригинальной конструкции [7]. Электростимулятором «Digitimer MultiStimul D330» подавали в течение 2 мин прямоугольные импульсы амплитудой 10 В и продолжительностью 0,5 мс при частоте 0,1 Гц. Силу сокращений мышц регистрировали с помощью датчика двигательной активности «Linton FСG-01», аналоговый сигнал преобразовывали в системе сбора данных «Biopack MP100МSW».

Изначальная нагрузка на мионевральные препараты составляла 1 г на m. soleus и m. diaphragma и 0,5 г на m. EDL. После получасовой адаптации мышечных препаратов к среде дважды с интервалом в 5 мин производили оценку стабильности сократительных ответов [8].

Для изучения эффектов пуринергических агонистов и антагонистов в ванночку добавляли 100 мкМ АТФ и через 10 мин оценивали механические ответы мышц. Затем проводили 20-минутную отмывку раствором Кребса с повторной стимуляцией. Для подтверждения синаптической природы эффектов АТФ использовали неселективный антагонист Р2-рецепторов сурамин в концентрации 100 мкМ в течение 20 мин с последующим добавлением 100 мкМ агониста Р2-рецепторов (АТФ) и вновь регистрировали механические ответы мышц. В контрольных экспериментах нервно-мышечную ткань инкубировали сурамином в концентрации 100 мкМ, через 20 мин регистрировали сократительные ответы мышц, возникающие в ответ на непрямую стимуляцию электрическим током [9].

Полученные в течение 2 мин ответы (12 сокращений) усредняли и обрабатывали как один результат в % от исходных результатов, полученных в начале эксперимента. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы «SPSS Statistics». Проверку соответствия нормальному распределению проводили с помощью критерия Колмогорова. Статистическую значимость оценивали с помощью многофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) для независимых и попарно сопряжённых выборок. Различия считали значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

После спинализации сократительные ответы m. soleus и m. EDL демонстрируют разнонаправленные изменения в силе сокращений и модификацию временных параметров (рис. 2; табл. 1). В отличие от них m. diaphragma сохраняет стабильность амплитудно-временных параметров, что может быть связано с более высоким положением тел мотонейронов диафрагмального нерва, в меньшей степени затронутых при спинализации.

 

Рис. 2. Вид одиночных сократительных ответов m. soleus, m. EDL и m. diaphragma, вызванных электрической стимуляцией в норме и после спинализации (представлены отдельные репрезентативные треки).

Fig. 2. Traces of single contractile responses of the isolated rat m. soleus, m. EDL and m. diaphragma evoked by electrical stimulation in controls and in spinalized rats (selected representative traces are presented).

 

Аппликация 100 мкМ АТФ на мышцы интактных грызунов модулирует параметры сокращения: 10-минутная аппликация АТФ снижала силу сокращения локомоторных m. soleus и m. EDL и усиливала сократимость дыхательной m. diaphragma. На нервно-мышечные препараты животных, подвергнутых предварительной спинализации, АТФ практически не действовала. Только m. diaphragma не утрачивала чувствительности к исследуемому нуклеотиду (таблица).

 

Зависимость сократительных параметров исследованных мышц крыс, вызванных электрической стимуляцией, от экспериментальных условий, n = 10–12

Parameters of rat muscle contractility evoked by electrical stimulation in different experimental conditions, n = 10–12

Экспериментальные условия Experimental conditions	n	Параметр Parameter	Контроль Control	АТФ, 100 мкМ ATP, 100 μМ	Сурамин, 100 мкМ Suramin, 100 μМ	Сурамин, 100 мкМ + АТФ, 100 мкМ Suramin, 100 μМ + ATP, 100 μМ
M. soleus
Норма Normal value	10	СС | CF	100,0 ± 4,2	67,6 ± 5,2*	104,3 ± 3,9	98,5 ± 7,1
		ВС | CT	0,081 ± 0,004	0,083 ± 0,006	0,080 ± 0,004	0,079 ± 0,005
		ВП/2 | RT/2	0,092 ± 0,007	0,105 ± 0,011	0,090 ± 0,006	0,093 ± 0,010
Спинализация Spinalization	10	СС | CF	119,8 ± 5,1#	114,0 ± 6,1#	120,2 ± 4,3#	121,8 ± 6,4#
		ВС | CT	0,073 ± 0,005	0,076 ± 0,007	0,071 ± 0,006	0,074 ± 0,004
		ВП/2 | RT/2	0,101 ± 0,009	0,116 ± 0,010	0,098 ± 0,008	0,105 ± 0,010
M. EDL
Норма Normal value	10	СС | CF	100,0 ± 4,5	86,2 ± 3,9*	102,0 ± 6,1	98,7 ± 5,3
		ВС | CT	0,057 ± 0,003	0,056 ± 0,005	0,059 ± 0,004	0,058 ± 0,006
		ВП/2 | RT/2	0,067 ± 0,005	0,069 ± 0,004	0,065 ± 0,007	0,068 ± 0,005
Спинализация Spinalization	10	СС | CF	88,7 ± 3,8#	83,1 ± 5,4	85,9 ± 4,8#	83,1 ± 6,7#
		ВС | CT	0,068 ± 0,005	0,069 ± 0,006	0,068 ± 0,006	0,067 ± 0,005
		ВП/2 | RT/2	0,071 ± 0,006	0,073 ± 0,007	0,070 ± 0,005	0,073 ± 0,004
M. diaphragma
Норма Normal value	12	СС | CF	100,0 ± 3,7	114,6 ± 5,2*	98,3 ± 4,7	102,9 ± 6,2
		ВС | CT	0,065 ± 0,004	0,066 ± 0,003	0,064 ± 0,006	0,064 ± 0,004
		ВП/2 | RT/2	0,075 ± 0,006	0,075 ± 0,005	0,074 ± 0,006	0,076 ± 0,004
Спинализация Spinalization	12	СС | CF	103,2 ± 4,1	112,7 ± 3,9*	102,0 ± 4,9	103,8 ± 7,5
		ВС | CT	0,071 ± 0,005	0,070 ± 0,003	0,069 ± 0,004	0,072 ± 0,004
		ВП/2 | RT/2	0,074 ± 0,003	0,076 ± 0,006	0,074 ± 0,005	0,075 ± 0,006

Примечание. *р < 0,05 по сравнению с контролем; ^#р < 0,05 по сравнению с нормой. СС — сила сокращения (в % от контроля); ВС — время сокращения (в с); ВП/2 — время полурасслабления (в с).

Note. *р < 0.05 compared with the control group; ^#р < 0.05 compared with normal value. CF — contractile force (% from the level in the control group); CT — contractile time, sec; RT/2 — half-relaxation time, sес.

 

Неконкурентный блокатор Р2-рецепторов сурамин (100 мкМ) не проявил достоверных эффектов. Действие экзогенной АТФ (100 мкМ) на всех исследуемых объектах на фоне сурамина (100 мкМ) полностью угнеталось (таблица).

Полученные нами данные демонстрируют значительное ухудшение функции периферической нервной системы у животных с моделью травмы спинного мозга. Изменение в синаптическом звене передачи сигнала свидетельствует в пользу дегенерационных изменений в аксонах после поражения верхнего уровня спинного мозга.

Механизмы, лежащие в основе угнетения функции периферической нервной системы, важны для предотвращения ухудшения состояния и поддержания высокого потенциала восстановления движений, особенно с помощью клеточной терапии, направленной на восстановление повреждённого спинного мозга.

Нарушение функциональной активности мышечных систем организма, пострадавшего от травмы спинного мозга, может быть связано как непосредственно с механическим повреждением, так и с вторичными патофизиологическими процессами, являющимися следующим этапом ответных реакций на первоначальное травмирую- щее событие. К примеру, имеются исследования, демонстрирующие аномально высокий и устойчивый уровень высвобождения АТФ в перитравматических областях у крыс с моделью травмы спинного мозга, что непосредственно указывает на вовлечённость P2-рецепторного пути в процессы вторичного повреждения тканей и нейродегенерации после первичного травмирования [10].

Каскад повреждения тканей включает обширное кровоизлияние, некроз клеточных компонентов центральной и периферической нервных систем. Происходящая в дальнейшем активация астроцитов и других клеток, расположенных в непосредственной близости от очага повреждения, приводит к созданию крайне неблагоприятной среды для восстановления аксонов. Протекающая одновременно с этим активация иммунной системы приводит к дополнительному усугублению состояния тканей в патологическом очаге за счёт привлечения клеток иммунного воспаления, таких как нейтрофилы и макрофаги. С другой стороны, макрофаги и Т-хелперы обеспечивают трофическую поддержку повреждённых компонентов центральной нервной системы. Все вышеперечисленные процессы в конечном счёте приводят к оголению аксонов нервных клеток и, как следствие, нарушениям проводимости по ним, что в первую очередь выражается в различных функциональных нарушениях мышечной системы [11].

Полученные данные демонстрируют наличие существенных различий в механизмах контроля сократительной деятельности у «быстрых» и «медленных» скелетных мышц теплокровных, что согласуется с более ранними нашими наблюдениями в условиях спинального шока [12]. Угнетение эффектов Р2-модуляторов на сокращение мышц при столь разительной реакции на спинализацию демонстрирует вовлечённость пуринергического звена в нейротрофическом контроле и функционировании различных двигательных единиц.

Активация спинальной микроглии вследствие травматического события влечёт за собой повышение экспрессии P2-рецепторов. Например, доказано увеличение количества P2X4R при травмах спинного мозга, а блокирование P2X4R приводило к уменьшению нейропатической боли [13]. Другой АТФ-чувствительный пуринергический рецептор — P2X7 необычен тем, что он может образовывать макромолекулярную пору при повторном или длительном воздействии высоких концентраций АТФ [14], что наиболее важно, если учитывать многократное увеличение высвобождения АТФ в перитравматических областях. Данный рецептор особенно важен в контексте травм спинного мозга из-за его широкой экспрессии на нейронах центральной нервной системы [10]. Среди других подтипов рецепторов существуют данные о возможном участии P2Y6, P2Y13 и P2Y14 в физиологических реакциях микроглии [15, 16].

Несмотря на серьёзность повреждения, даже при обширной травме спинного мозга на уровне грудных сегментов электростимуляция, производимая несколько ниже уровня повреждения, позволяет зарегистрировать стабильную ритмическую двигательную активность задних конечностей, что было продемонстрировано в ряде исследований на животных [17, 18].

Блокада пуринергических рецепторов может улучшить исход травмы спинного мозга. Например, интраспинальная инъекция антагониста P2X7-рецепторов в перитравматическую зону уменьшала повреждение спинного мозга [10]. Ингибирование P2X7R не только снижало потерю двигательных нейронов, но и способствовало последующему функциональному восстановлению травмированных животных.

С другой стороны, нарушение мембраны аксона при повреждении сопровождается быстрыми изменениями внутриклеточных концентраций ионов. Воздействие АТФ на нейроны спинного мозга проявляется возбуждением, которое приводит к устойчивому необратимому повышению уровня Ca²⁺ и в конечном итоге к гибели клеток [10].

К тому же в ряде фундаментальных исследований с использованием животных моделей продемонстрированы патологические изменения в скелетной мускулатуре, развивающиеся вследствие травмы спинного мозга: высвобождение большого количества АТФ из повреждённых тканей приводит к развитию не только местного, но и генерализованного воспалительного процесса с высвобождением провоспалительных цитокинов (в частности, интерлейкинов-1 и -6), что опосредует развитие изменений мускулатуры, похожих на постденервационные [14]. АТФ активирует ионотропные P2XR, в частности P2X7, что в основном приводит к увеличению концентрации внутриклеточного Ca²⁺ и в дальнейшем к реорганизации цитоскелета, воспалению, апоптозу/некрозу и пролиферации, обычно в длительной перспективе [19].

Заключение

Таким образом, совокупность известных к настоящему моменту данных только намечает пути выявления механизмов описанных нами эффектов. Требуются дальнейшие исследования участия P2-сигнализации в процессах, возникающих после спинализации.

Продемонстрированная нами аномальная модуляция АТФ нервно-мышечного перехода предоставляет доказательства дегенерации аксонов и позволяет предположить, что транссинаптическая дегенерация двигательных нейронов может происходить ниже уровня поражения спинного мозга при подобных травмах.

About the authors

Adel E. Khairullin

Kazan State Medical University; Kazan (Volga Region) Federal University

Author for correspondence.
Email: khajrulli@ya.ru
ORCID iD: 0000-0001-6155-622X

Cand. Sci. (Biol.), Assistant Professor, Department of biochemistry and clinical laboratory diagnostics, Kazan State Medical University; senior researcher, Research laboratory «Mechanobiology», Institute of Fundamental Medicine and Biology, Kazan Federal University

Russian Federation, Kazan; Kazan

Dina V. Efimova

Kazan State Medical University

Email: khajrulli@ya.ru
ORCID iD: 0009-0000-3966-0813

postgraduate student, Department of biochemistry and clinical laboratory diagnostics, Kazan State Medical University

Russian Federation, Kazan

Marat A. Mukhamedyarov

Kazan State Medical University

Email: marat.muhamedyarov@kazangmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-0397-9002

D. Sci. (Med.), Professor, Head, Department of normal physiology, Kazan State Medical University

Russian Federation, Kazan

Maxim E. Baltin

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: khajrulli@ya.ru
ORCID iD: 0000-0001-5005-1699

researcher, Research laboratory «Mechanobiology», Institute of Fundamental Medicine and Biology, Kazan Federal University

Russian Federation, Kazan

Tatiana V. Baltina

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: khajrulli@ya.ru
ORCID iD: 0000-0003-3798-7665

Cand. Sci. (Biol.), Associate Professor, Head, Research laboratory «Mechanobiology», Institute of Fundamental Medicine and Biology, Kazan Federal University

Russian Federation, Kazan

Sergey N. Grishin

Kazan State Medical University

Email: sgrishin@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-2851-579X

D. Sci. (Biol.), Professor, Department of medical and bio- logical physics with computer science and medical equipment, Kazan State Medical University

Russian Federation, Kazan

Airat U. Ziganshin

Kazan State Medical University

Email: airat.ziganshin@kazangmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-9087-7927

D. Sci. (Med.), Professor, Head, Department of pharmacology, Kazan State Medical University

Russian Federation, Kazan

References

Supplementary files