Immunomorphologic assessment of changes in functional astroglial proteins in a kainate-induced hippocampal sclerosis model

Full Text

Введение

Около трети случаев заболевания эпилепсией являются фармакорезистентными [1], поэтому исследование механизмов эпилептогенеза и поиск новых терапевтических мишеней являются важнейшими задачами трансляционных нейронаук. На молекулярном и морфологическом уровнях эпилепсия характеризуется нейродегенерацией, аномальными формами нейропластичности, нарушениями нейрогенеза, изменением топологии межнейронных связей, нейромедиаторным дисбалансом, нарушением функциональной способности ряда рецепторных комплексов и модификацией молекулярной структуры ионных каналов [2].

Самым частым гистологическим диагнозом у взрослых пациентов, оперированных по поводу фокальной структурной фармакорезистентной эпилепсии, является склероз гиппокампа (СГ) [3, 4], характеризующийся гибелью нейронов отдельных полей гиппокампа. Ведущей причиной гибели нейронов при СГ признают глутаматергическую эксайтотоксичность, вызываемую избыточным выбросом глутамата при эпилептической активности [5]. Поскольку астроглия выполняет гомеостатические функции, в том числе контролирует уровень внеклеточного глутамата, она непосредственно участвует в эксайтотоксических каскадах реакций. Кроме того, астроциты, модулируя синаптическую передачу, обеспечивают энергетическую поддержку нейронов, участвуют в нейровоспалении и синаптической пластичности [6]. Нарушение астроцитарных функций — одна из важных причин эпилептизации мозга [7].

При СГ выделяют несколько паттернов повреждения, сопровождающихся разной выраженностью астроглиоза (пролиферации и гипертрофии астроцитов). Наиболее часто (60–80% случаев) встречается тип 1 по классификации Международной противоэпилептической лиги с наиболее выраженным повреждением полей CA1 и CA3 и затрагивающий CA2 и зубчатую извилину (dentate gyrus, DG) [4]. При СГ типа 2 преимущественно поражается поле CA1, а тип 3 характеризуется наибольшим повреждением нейронов хилуса (иначе обозначаемого как поле CA4). Выраженность астроглиоза, в особенности в поле CA3, показывает прямую корреляцию с частотой и тяжестью эпилептических приступов как до, так и после резекции гиппокампа [8].

До 20% случаев височной эпилепсии характеризуются отсутствием выраженной гибели нейронов при реактивных изменениях астроглии, что, согласно A. Grote и соавт., не предшествует СГ 1–3 типов, а является отдельным состоянием [9]. Вопросы причинно-следственной связи реактивных изменений астроглии и повреждения нейронов гиппокампа остаются нерешёнными.

Эпилептогенез при височной эпилепсии связан с аномальным прорастанием мшистых волокон (аксонов гранулярных клеток DG) в молекулярный слой DG и формированием новых возбуждающих синапсов. Реорганизация нейронной сети гиппокампа ведёт к гиперсинхронизации и генерации эпилептических разрядов [10], в чём важную роль играет дисфункция глиальных клеток.

Распространённой хронической моделью височной эпилепсии, воспроизводящей патоморфологические признаки СГ, является введение каиновой кислоты (КК) — агониста каинатных рецепторов, подтипа ионотропных глутаматных рецепторов. Эффекты КК, в зависимости от действия на пре-, постсинаптические или глиальные каинатные рецепторы, включают, помимо увеличения возбудимости глутаматергических пирамидных нейронов поля CA3 и подавления высвобождения ГАМК, «реактивную» пластичность гранулярных нейронов DG, а также провоспалительные реакции глии и изменения высвобождения нейротрофных факторов и глиотрансмиттеров (сигнальных молекул, обеспечивающих коммуникацию между глиальными клетками и контролирующих возбудимость нейронов) [11].

Астроциты вовлечены в регуляцию глутаматергической нейротрансмиссии, они контролируют уровень внеклеточного глутамата с помощью транспортёров ЕААТ1 (GLAST) и ЕААТ2 (GLT-1) и участвуют в метаболизме и детоксикации глутамата с помощью глиоспецифичного фермента — глутаминсинтетазы (GS) [12]. Астроциты формируют так называемые «трёхчастные синапсы», окружая область синаптического контакта нейронов своими отростками, что позволяет им модулировать нейротрансмиссию. Астроциты также высвобождают глиотрансмиттеры, к которым относят пурины, D-серин и различные лиганды рецепторов глутамата, воздействующие на возбудимость нейронов [6]. Регуляция групповой активности нейронов обеспечивается благодаря межастроцитарным сетям, сформированным с помощью белков щелевых контактов коннексинов (Cx30, Cx43), участвующих в транспорте малых молекул и организации глиальной сети, регуляции транспорта глутамата, диффузии энергетических метаболитов и глиотрансмиттеров [6, 13]. Одним из факторов, обусловливающих гипервозбудимость нейронов, является нарушение водного баланса нервной ткани, в регуляции которого ведущая роль принадлежит белку водных каналов — аквапорину-4 (AQP4) [12, 14]. Локализованный в дистальных отделах отростков астроцитов AQP4, как и Cx43, связан с перераспределением ионов и воды в межклеточном пространстве, влияет на концентрацию нейротрансмиттеров и участвует в регуляции объёма астроцитарных перисинаптических муфт. Кроме того, AQP4 и Cx43 участвуют в миграции астроцитов и регуляции подвижности их отростков [13], что подчёркивает их значение при глиозе и перестройке ткани.

Структурные и функциональные характеристики нейро- глиоваскулярных взаимодействий в структурах мозга определяются региональными особенностями астроглии [12]. Глиоархитектоника гиппокампа, как и других структур мозга, тесно связана с его синаптической организацией. Астроциты разных отделов и слоёв гиппокампа отличаются морфологической, нейрохимической и функциональной гетерогенностью [15, 16]. Региональные особенности, по-видимому, связаны не только с функцио- нированием структур в норме, но и определяют особенности ответа астроцитов на патологические процессы, а реактивная астроглия, в свою очередь, сохраняет региональный профиль экспрессии гомеостатических генов [17]. К числу генов, уровень экспрессии которых определяет региональную специфичность астроглии гиппокампа, относят slc1a2 (EAAT2), slc1a3 (EAAT1), Gja1 (Cx43), Glul (GS), Aqp4 [16, 18]. Важно, что нарушения регуляции отдельных групп генов могут затрагивать определённые субпопуляции астроглии [19]. Взаимосвязь AQP4, Cx43, ЕААТ1/EAAT2 и формирование ими на мембране астроцитов макромолекулярных комплексов [20] требуют совместной оценки изменений этих функциональных белков при СГ.

Таким образом, данные современных экспериментальных исследований указывают на значительный вклад астроглии в эпилептогенез, однако роль астроглии в патогенезе СГ на сегодняшний день изучена недостаточно.

Цель настоящего исследования — оценка регионально-специфических изменений распределения функциональных белков астроглии в реактивных астроцитах при каинат-индуцированном СГ.

Материалы и методы

В исследование были взяты 10 крыс-самцов Вистар в возрасте 3,5–5,0 мес массой 300–350 г, полученные из питомника ФГБУН НЦБМТ ФМБА «Столбовая». Животные содержались в условиях вивария при постоянном доступе к воде и корму. Эксперимент проводили с соблюдением биоэтических норм по работе с лабораторными животными в соответствии с требованиями European Convention for the Protection of Vertebral Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes (CETS No. 170). Исследование одобрено этическим комитетом Научного центра неврологии (протокол № 5-3/22 от 01.06.2022).

Стереотаксические инъекции

Для анестезии применяли золетил-ксилазиновый наркоз после премедикации атропином (ОАО «Дальхимфарм») в дозе 0,04 мг/кг подкожно за 10–15 мин. Затем последовательно внутримышечно вводили смесь золазепама гидрохлорида и тилетамина гидрохлорида (0,3 мг/кг в составе Золетил-100, «Virbac») и ксилазина гидрохлорид (3 мг/кг, Ксила, «De Adelaar»).

Раствор KК («Sigma») в дозе 0,5 мкг в 3 мкл физиологического раствора вводили с помощью стереотаксического манипулятора «RWD», в поле CA1 рострального отдела гиппокампа справа (n = 5) в соответствии с координатами (АР = –3,0; ML = 2,0; DV = 2,8) по атласу мозга крысы¹. С левой стороны вводили физиологический раствор в том же объёме. Ложнооперированным (контрольным) крысам (n = 5) билатерально вводили по 3 мкл физиологического раствора.

Иммунофлюоресцентное окрашивание

Через 28 сут после введения КК животных декапитировали с помощью гильотины, мозг извлекали, рассекали во фронтальной плоскости и фиксировали 24 ч в 4% нейтральном формалине. После пропитывания 30% раствором сахарозы образцы помещали в среду O.C.T. («TissueTek») и готовили серии замороженных фронтальных срезов (толщиной 12 мкм) на уровне фронтальной трети гиппокампа. Срезы нагревали в пароварке, в цитратном буфере pH 6,0 («Leica») в течение 15 мин. Окрашивание проводили в соответствии с рекомендациями производителей первичных антител. Использовали антитела к нейрональным белкам NeuN («Abcam», ab104224) и синаптофизину (SF, «Sigma», S5768) и антитела к белкам астроцитов: транспортёрам глутамата EAAT1 (GLAST, «Abcam», ab181036) и EAAT2 (GLT1, «Abcam», ab203130), GS («Sigma», G2781), Cx43 («Abcam», ab11370), AQP4 («Sigma», HPA014734), виментину (Vim, «Abcam», ab92547) и глиофибриллярный белок (GFAP; «Abcam», ab207165). Для выявления микроглии использовали антитела к IBA1 («GeneTex», GTX635399). Первичные антитела инкубировали со срезами во влажной камере 18 ч при комнатной температуре. После этого для выявления связывания использовали соответствующие антитела («Invitrogen») к иммуноглобулинам мыши или кролика, меченные флуорохромами «Alexa Fluor 488» или «Alexa Fluor 555». Срезы заключали в среду «Fluoroshield» («Abcam»), содержащую 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) для окрашивания ядер клеток.

Морфометрия

От каждого животного на уровне ростральной трети гиппокампа исследовали 6–12 срезов, взятых с равными интервалами по рострокаудальной оси. Срезы документировали, используя микроскоп «Nikon Eclipse Ni-U», и на изображениях, полученных при увеличении объектива ×20, оценивали с помощью программы «ImageJ» среднюю интенсивность флуоресценции ткани (с коррекцией фонового окрашивания) в градациях яркости 8-битного изображения.

Окрашивание на нейрональные и глиальные белки позволило, помимо полей (секторов) гиппокампа (CA1, CA2, CA3, DG), дифференцировать слои поля CA3: молекулярный лакунозный слой (stratum lacunosum-moleculare), лучистый (str. radiatum), прозрачный (str. lucidum), пирамидный (str. pyramidale), краевой (str. oriens). В DG выявляли слой гранулярных клеток (str. granulare) и полиморфный слой (хилус, stratum polymorphe) [21].

Измерения выполняли в секторе СA3 в целом и в stratum lucidum в отдельности, а также в полиморфном слое DG правого (ипсилатерального повреждению) и левого (контралатерального) гиппокампов животных, получавших КК, и справа (на стороне введения 0,9% NaCl) — для контрольных животных. Области интереса сегментировали на изображениях вручную. Для оценки площади AQP4⁺-сосудов с помощью локальной пороговой сегментации в «ImageJ» выделяли площадь сосудов по отношению к площади поля зрения. Для оценки распределения Cx43 в ткани использовали анализ текстуры изображения GLCM (Gray level co-occurence matrix). Показатель GLCM contrast обратен изменению гомогенности распределения выявляемого маркера. Применение метода GLCM для гистологических изображений описано ранее [22].

Статистическая обработка

Полученные для каждого животного значения усредняли. Статистическую обработку проводили в программе «GraphPad Prism 7.0». Для выявления различий между группами использовали двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с апостериорным тестом Тьюки. Данные представлены в виде M ± SD, где M — среднее, SD — среднеквадратичное отклонение. При отклонении от нормального распределения по результатам теста Шапиро–Уилка (данные для SF) использовали тест Вилкоксона для сравнения полушарий. Данные для SF представлены как медиана (Me) и интерквартильный размах [Q₁; Q₃]. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты

Повреждение нейронов поля CA3 обнаруживали у всех животных, получавших КК (рис. 1, А). Оценка интенсивности окрашивания на маркер нейронов NeuN показала значимое (p < 0,001) снижение до 60,63 ± 22,11% в пирамидном слое поля CA3 на стороне введения токсина по сравнению с контрольной группой, но не на противоположной стороне (89,8 ± 16,8% от контроля). Повреждение нейронов выявили и в поле CA1, однако в связи с близостью трека иглы и активацией глии, обусловленной механическим повреждением, эта область гиппокампа была в нашем исследовании исключена из анализа. В DG значимого снижения окрашивания на NeuN не выявили. Интенсивность окрашивания на SF в stratum lucidum на стороне введения токсина (Me = 73,44 [67, 76; 87, 15]) была значимо (p < 0,05, тест Вилкоксона) выше по сравнению с противоположным гиппокампом (Me = 68,12 [56, 67; 77, 81]).

 

Рис. 1. Интрагиппокампальное введение КК вызывает повреждение нейронов поля CA3 и активацию глии в DG.

А — выявление нейронального маркера NeuN (окрашено красным), поле CA3, × 10;

В — активация астроцитов, GFAP (окрашено зелёным), DG, × 20;

С — гипертрофия микроглии, IBA1 (окрашено зелёным), поле CA3, × 40;

D — экспрессия виментина (окрашено зелёным), реактивными астроцитами полиморфного слоя гиппокампа, × 20.

CA3 pyr — пирамидный слой поля CA3; DG pol — полиморфный слой, DG gr — гранулярный слой, * область повреждения. Ядра окрашены DAPI (синим).

Fig. 1. Administration of KA into the hyppocampus resulted in neuronal damage in the CA3 region and glia activation in the DG.

A, detection of NeuN neuronal marker (stained with red), CA3, × 10;

В, astrocyte activation, GFAP (stained with green), DG, × 20;

С, microglia hypertrophy, IBA1 (stained with green), CA3, × 40;

D, expression of vimentin (stained with green) by reactive astrocytes of the polymorphic layer of the hippocampus, × 20.

CA3 pyr, pyramidal layer of CA3; DG pol, polymorphic layer, DG gr, granular layer, * damage area. Nuclei stained with DAPI (blue).

 

Как в поле CA3, так и в DG гиппокампа отмечали выраженный глиоз, усиление окрашивания на GFAP, гипертрофию и деформацию отростков астроцитов (рис. 1, В), а также активацию микроглии (рис. 1, С). Часть астроцитов как в CA3, так и в DG экспрессировала Vim, что характерно для незрелых и реактивных астроцитов, при этом наибольшую интенсивность окрашивания на Vim отмечали в DG. Обращает на себя внимание, что тела Vim⁺-астроцитов были наиболее изменены (рис. 1, D).

Следовательно, введение КК вызывало активацию астроцитов как непосредственно в области максимального повреждения нейронов (в поле CA3), так и в полиморфном слое DG, без потери нейронов в последнем.

Границы stratum lucidum, формируемого преимущественно аксонами зернистых нейронов DG, выявлялись как с помощью окрашивания на SF, так и при выявлении глиальных маркеров (рис. 2), за исключением относительно однородного окрашивания на AQP4. Наибольшие отличия в окрашивании между слоями поля CA3 визуально отмечали для EAAT1 и Cx43, причём stratum lucidum отличался наиболее низким их содержанием.

 

Рис. 2. Изменения экспрессии и локализации функциональных белков астроцитов в слоях поля CA3 гиппокампа под действием КК.

А — выявление локализации GS (окрашено зелёным) и SF (окрашено красным) в слоях гиппокампа, × 10;

В — выявление EAAT1, × 10;

С — выявление Cx43 (окрашено зелёным), ядра докрашены DAPI (окрашено синим), × 20;

D — выявление AQP4, × 10.

so — stratum oriens; pyr — stratum pyramidalis; sl — stratum lucidum; sr — stratum radiatum; slm — stratum lacunosum molecularis.

Fig. 2. Changes in expression and localization of astrocyte functional proteins in hippocampal CA3 layers after administration of KA.

A, identification of GS localization (stained with green) and SF (stained with red) in hippocampus layers, × 10;

В, EAAT1 detected, × 10;

С, Cx43 detected (stained with green), nuclei further stained with DAPI (stained with blue), × 20;

D, AQP4 detected, × 10.

so, stratum oriens; pyr, stratum pyramidalis; sl, stratum lucidum; sr, stratum radiatum; slm, stratum lacunosum molecularis.

 

Помимо резкого роста интенсивности иммунофлуоресценции для GFAP (p < 0,001) в поле CA3 (без учёта слоёв, по сравнению с ложнооперированным контролем), на стороне введения КК увеличивалось содержание Cx43 (p < 0,001) и GS (p < 0,001), а окрашивание на AQP4 значимо (p < 0,001) снижалось (рис. 2, 3).

 

Рис. 3. Изменения интенсивности иммунофлюоресцентного окрашивания на функциональные белки астроцитов в поле CA3 гиппокампа (CA3 total), stratum lucidum (CA3 sl) и полиморфном слое DG (DG pl) под действием КК.

А — транспортёр глутамата EAAT1 (GLAST); В — транспортёр глутамата EAAT2 (GLT-1); С — Cx43; D — GS; E — AQP4; F — GFAP.

sham — ложнооперированные животные; ipsi — на стороне повреждения; contra — контралатерально повреждению; *p < 0,05 по сравнению с ложнооперированными животными; ^#p < 0,05 по сравнению со стороной повреждения (ANOVA, апостериорный тест Тьюки).

Fig. 3. Changes in immunofluorescent staining intensity for functional astrocyte proteins in CA3 of the hippocampus (CA3 total), stratum lucidum (CA3 sl), and the polymorphic layer of DG (DG pl) after administration of KA.

А, EAAT1 glutamate transporter (GLAST); В, EAAT2 glutamate transporter (GLT-1); С, Cx43; D, GS; E, AQP4; F, GFAP.

sham, sham-operated animals; ipsi, on damage side; contra, contralateral to damage side; *p < 0.05 compared with sham-operated animals; ^#p < 0.05 compared with damage side (ANOVA, Tukey’s post-hoc test).

 

На фоне снижения интенсивности иммунофлуоресценции для AQP4 в поле CA3 более отчётливо выявлялись тела глиальных клеток и отмечалось снижение интенсивности окрашивания сосудов, что свидетельствует о перераспределении AQP4 в клетках и снижении его содержания в концевых ножках астроглии. Это подтверждается измерениями доли площади окрашенных сосудов в поле зрения: в поле CA3 она была значимо (p = 0,022) снижена с 0,99 ± 0,48% у контрольной группы до 0,55 ± 0,15% на стороне введения КК. В DG выявили сходные изменения.

Рост общей интенсивности флюоресценции (рис. 3) в поле CA3 для Cx43 преимущественно происходил за счёт глиальных клеток в stratum oriens и stratum lacunosum molecularis. Изменение распределения Cx43 в ткани подтвердила оценка «контраста» изображения — показателя обратного гомогенности распределения выявляемого маркера в образце. В поле CA3 этот показатель значимо (p = 0,021) возрастал втрое (214,49 ± 116,51) по сравнению с контролем (70,97 ± 2,41) на стороне введения КК. Выявленное снижение однородности распределения Cx43, по-видимому, отражает перераспределение Cx43 в отростках астроцитов. Интересно, что у животных, получавших КК, отмечали крупные Cx43⁺-кластеры окрашивания вокруг сосудов, что может быть связано с увеличением экспрессии Cx43 эндотелиоцитами или нарушением его распределения в концевых ножках астроглии.

Распределение GS также менялось в слоях гиппокампа по-разному. На стороне введения КК в поле CA3 выявляли большое количество редких у контрольных животных овоидных GS⁺-глиальных клеток с интенсивным окрашиванием цитоплазмы, вероятно, относящихся к олигодендроглии. В stratum lucidum наблюдали снижение окрашивания на GS в отростках астроцитов (рис. 3, 4). При этом в stratum oriens, startum radiatum и stratum lacunosum molecularis выявляли GS⁺-реактивные астроциты с гипертрофированными отростками и интенсивно окрашенной цитоплазмой.

 

Рис. 4. Изменения внутриклеточной локализации EAAT2 и GS в астроцитах под действием КК.

А — интенсивное окрашивание на транспортёр глутамата EAAT2 (окрашено зелёным) в телах реактивных астроцитов полиморфного слоя, × 40; В — выявление GS (окрашено зелёным) и SF (окрашено красным) в отростках и телах реактивных астроцитов (стрелки) в stratum lucidum и клетках без выявляемых отростков (отрезки с точкой на конце), × 40.

DG gr — гранулярный слой; DG pol — полиморфный слой; sl — stratum lucidum; sr — stratum radiatum.

Fig. 4. Changes in intracellular EAAT2 and GS location in astrocytes after KA administration.

А, intense staining for EAAT2 glutamate transporter (green) in reactive astrocyte bodies of the polymorphic layer, × 40;

B, GS detected (stained with green) and SF (stained with red) in the processes and bodies of reactive astrocytes (arrows) in stratum lucidum and cells without processes identified (line segments with a dot at the end), × 40.

DG gr, granular layer; DG pol, polymorphic layer; sl, stratum lucidum; sr, stratum radiatum.

 

Для транспортёра глутамата EAAT1 среднее значение интенсивности в поле CA3 без учёта слоев значимо увеличилось (p = 0,0149) под действием КК на стороне повреждения, а визуально отмечали наличие зон как с повышенной, так и с пониженной экспрессией EAAT1, что может быть связано с разной степенью повреждения нейронов в поле CA3.

При оценке иммунофлюоресценции в stratum lucidum на стороне введения КК (рис. 3) выявили значимое по сравнению с ложнооперированным контролем снижение содержания функциональных белков астроцитов: EAAT1, EAAT2, GS и AQP4, за исключением Cx43 (для которого выявляли тенденцию к увеличению окрашивания; p = 0,053). В stratum lucidum гиппокампа противоположного полушария также отмечали снижение иммунофлюо-ресценции, наибольшее для GS и AQP4.

Сходное с изменениями в stratum lucidum, однако менее резко выраженное снижение содержания исследованных белков (EAAT1, GS, AQP4) установлено и в полиморфном слое DG гиппокампа (рис. 3), что, вероятно, связано с общей направленностью изменений астроглии в областях синаптических контактов мшистых волокон с нейронами. Обращает на себя внимание, что только для EAAT2 были выявлены противоположные изменения (увеличение иммуноокрашивания) в DG по сравнению с stratum lucidum. Увеличение интенсивности окрашивания на EAAT2, по-видимому, было зарегистрировано за счёт интенсивного окрашивания сомы реактивных астроцитов (рис. 4).

Таким образом, введение КК приводило к одностороннему повреждению пирамидных нейронов поля CA3 гиппокампа и глиозу, причём реактивные изменения астроглии сопровождались снижением экспрессии её функциональных гомеостатических белков в stratum lucidum — слое мшистых волокон как на стороне введения токсина, так и в противоположном полушарии. В поле CA3 при индуцированном КК повреждении наблюдали увеличение экспрессии GFAP, Vim, GS и Cx43, перераспределение AQP4 с умеренным снижением интенсивности иммуноокрашивания. В то же время реактивные изменения астроглии в stratum lucidum отличались от поля CA3 в целом и сопровождались значимым снижением белков обмена глутамата (GS, EAAT1/2) и AQP4, а содержание Cx43 значимо не менялось, хотя и имело тенденцию к повышению. Помимо изменений содержания Cx43, AQP4, GS и EAAT2, выявили и изменения их клеточной локализации и распределения в ткани, в том числе связанные с нарушением глиоваскулярных контактов.

Обсуждение

Интрагиппокампальное введение КК вызывало глиоз в областях CA3 и DG и выраженные в различной степени изменения региональной экспрессии функциональных белков астроцитов в поле CA3 в целом и в слое stratum lucidum. На стороне введения токсина выявляли повреждение нейронов в полях CA1 и CA3, соответствующее картине СГ типа 1 [4]. Обнаруженные изменения астроглии были характерны и для противоположного полушария, где статистически значимого повреждения нейронов не зарегистрировали.

Stratum lucidum поля CA3 гиппокампа представлен мшистыми волокнами — аксонами гранулярных клеток DG, формирующими множество глутаматергических «детонаторных» синапсов на пирамидных нейронах поля СА3. Их функциональное значение в эпилептогенезе и наблюдаемые при эпилепсии перестройки мшистых волокон определяют интерес к изменениям глиальных клеток в этой области [10]. Полученные нами данные о росте иммуноокрашивания на SF в stratum lucidum согласуются с данными литературы [23] о повышении его содержания через 30 дней после введения КК и могут свидетельствовать о «реактивной» пластичности.

Астроциты разных регионов гиппокампа различаются своими характеристиками, зависящими в том числе от «обслуживаемых» ими синапсов [15]. Хилус и stratum lucidum гиппокампа характеризуются относительно высокой плотностью астроглии [24]. Астроциты stratum lucidum отвечают изменениями внутриклеточного Ca²⁺ только на пачечную активность нейронов и значительный рост концентрации глутамата, в отличие от астроцитов DG, которые обеспечивают тонкую регуляцию синаптической передачи [25]. Контакты астроцитов с синаптическими бутонами на мшистых волокнах, по сравнению с синапсами других областей гиппокампа, менее тесные [25]. Интересной особенностью stratum lucidum является и крайне высокое содержание мозгового нейротрофического фактора [26], участвующего в регуляции морфогенеза астроглии и играющего роль в нейровоспалении [27, 28].

Охарактеризованные в нашем исследовании изменения содержания и локализации AQP4, глиальных транспортеров глутамата (EAAT1/EAAT2), GS и Сх43 ассоциированы с повышенной возбудимостью нейронов и связаны с инициацией и поддержанием эпилептической активности [7]. Отметим, что наблюдаемые в работах разных авторов противоречия в изменениях этих белков связаны с методами измерения, анализируемыми областями и сроками введения КК. Например, через 1 сут после вызванного введением КК эпилептического статуса содержание AQP4 в гиппокампе крыс было снижено, однако возрастало по прошествии месяца [29]. С другой стороны, у пациентов с височной эпилепсией и СГ увеличивалось общее содержание AQP4, однако уменьшалось его иммуноокрашивание в периваскулярном пространстве [30]. В настоящем исследовании выявили согласующееся с другими авторами перераспределение AQP4 в астроцитах и снижение площади AQP4⁺-периваскулярного окрашивания, наряду с общим снижением содержания APQ4. Ранее на каинатной модели в полях СА1 и СА3 показано снижение содержания AQP4 в периваскулярном компарт- менте как в латентном, так и в позднем периоде эпилептогенеза [31]. Cубклеточное перераспределение AQP4 с преимущественной локализацией в нейропиле, но не в периваскулярных концевых ножках астроцитов выявили и на модели посттравматической эпилепсии [32].

Локализация AQP4 совместно с ЕААТ2 и Kir4 в виде макромолекулярного комплекса обусловливает его возможное участие в обмене К⁺ и глутамата [29, 33]. Предполагают, что нарушение ассоциации AQP4 и транспортёра глутамата EAAT2 в астроцитах приводит к нейрональной дисфункции [34, 35]. Оценка уровня AQP4 и ЕААТ2 на модели эпилепсии с KК показала снижение их экспрессии в раннем периоде эпилептогенеза [29], что согласуется с нашими результатами для stratum lucidum. Изменение распределения этих белков в отростках астроглии, показанное и в нашей работе, свидетельствует о нарушениях организации глиоваскулярных и глионейрональных контактов в концевых ножках астроцитов. Помимо этого, по данным литературы, глиальный транспортёр глутамата EAAT2 (но не EAAT1) напрямую ингибируется KК [36] и обнаруженный нами его рост в DG может отражать этап компенсаторного увеличения экспрессии. Разнонаправленные изменения EAAT2 в stratum lucidum и DG могут быть обусловлены гетерогенностью астроцитов данных зон гиппокампа или разной степенью выраженности их реакции.

В ряде работ отмечено повышение экспрессии и EAAT1 после введения КК, рассматриваемое авторами как компенсаторная реакция [36]. Нами выявлено повышение содержания EAAT1 в поле CA3, происходившее, однако, не за счёт астроглии stratum lucidum, где для обоих транспортёров, наоборот, выявили снижение окрашивания. В целом дисфункция транспортёров ЕААТ1/2 в эпилептических очагах приводит к нарушению утилизации внеклеточного глутамата [37], но описываемые изменения экспрессии этих белков у пациентов с височной эпилепсией часто противоречивы и демонстрируют разную направленность изменений [38, 39].

В предупреждении накопления токсического глутамата важную роль играет и специфичный для астроглии фермент глутамин-глутаматного обмена — GS. У пациентов с мезиально-височной эпилепсией интенсивность окрашивания на GS снижалась в полях СА1, СА3 и DG гиппокампа, демонстрируя связь с характером приступов [40]. В нашей работе обнаружено снижение интенсивности окрашивания на GS в отростках астроцитов stratum lucidum, но не в других слоях, где GS⁺-реактивные астроциты имели гипертрофированные отростки. Ранее перераспределение GS в отростках астроцитов в СА1-0 и СА3-областях гиппокампа показано на моделях височной эпилепсии [40, 41].

Возбудимость и синхронизация нейронов во многом регулируются также скоординированной работой астроцитарной сети при участии коннексинов. Генетический нокаут у животных Cx43 приводит к судорогам и двигательным нарушениям [42]. Нарушение связей между астроцитами способствует эпилептогенезу за счёт снижения буферизации К⁺, Na⁺ с последующим торможением клиренса глутамата из синаптической щели. В эксперименте показано нарушение коммуникации между астроцитами посредством Cx43 уже на ранних стадиях эпилептогенеза [43]. С другой стороны, функционирование астроцитарной сети необходимо для доставки энергетических субстратов [44], следовательно, сниженная коммуникация астроцитов может подавлять судорожную активность и быть защитной на поздних стадиях эпилептогенеза [45].

Анализ содержания Cx43 в образцах гиппокампа пациентов с СГ показал повышенную экспрессию Cx43, не образующего, однако, функционально состоятельных каналов [46], что связано с субклеточным перераспределением Cx43 в периваскулярных областях в сочетании с посттрансляционными модификациями белка, нарушающими проницаемость каналов. Сходные изменения мы наблюдали в настоящем эксперименте: был выявлен рост содержания Cx43 в поле CA3 в целом, и, хотя изменения интенсивности окрашивания в stratum lucidum не были cтатистически значимыми, в этом слое отмечали перераспределение Cx43 и формирование его кластеров вокруг сосудов. Ранее было показано, что изменения экспрессии и локализации AQP4 и Cx43 приводят к нарушениям проницаемости ГЭБ [20] и негативным эффектам. Обращает на себя внимание, что AQP4 и Cx43 разнонаправленно изменяют свою локализацию, при этом вокруг сосудов накапливается Cx43 и снижается иммунореактивность AQP4. Полученные результаты свидетельствуют о нарушении организации водных каналов и коннексинов в реактивных астроцитах, что, в свою очередь, может быть причиной нарушений ионного и водного гомеостаза [32] и вносить свой вклад в эпилептогенез.

Заключение

1. Реакция астроглии при каинат-индуцированном СГ неоднородна и характеризуется региональными особенностями, при этом наибольшую уязвимость демонстрируют астроциты stratum lucidum, ассоциированные с мшистыми волокнами.
2. Изменения экспрессии гомеостатических белков астроглии гиппокампа наблюдаются как в ипси-, так и в контралатеральном повреждению полушариях, что отягощает процесс эпилептизации в сохранном гиппокампе.
3. Изменения астроцитарных белков обмена глутамата при КК-индуцированном СГ усиливают нарушения нейротрансмиссии и могут провоцировать вторичное эксайтотоксическое повреждение нейронов при эпилептогенезе.
4. Нарушения локализации и экспрессии AQP4 и глиальных транспортёров глутамата носят однонаправленный характер, что указывает на общность их регуляторных механизмов и локальную дизрегуляцию астроцитами водного и ионного гомеостаза при СГ.
5. Нарушения периваскулярной локализации Cx43 и AQP4 отражают взаимозависимость двух классов мембранных белков и перестройку глиоваскулярных взаимодействий при СГ.

 

¹ Paxinos G., Watson Ch. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Amsterdam; Boston, 2005.

About the authors

Dmitry N. Voronkov

Research Center of Neurology

Author for correspondence.
Email: voronkov@neurology.ru
ORCID iD: 0000-0001-5222-5322

Cand. Sci. (Med.), senior researcher, Laboratory of neuromorphology, Brain Institute, Research Center of Neurology

Russian Federation, Moscow

Anna V. Egorova

Research Center of Neurology; Pirogov Russian National Research Medical University

Email: av_egorova@bk.ru
ORCID iD: 0000-0001-7112-2556

Cand. Sci. (Med.), researcher, Neuromorphology laboratory, Brain Institute, Research Center of Neurology; Associate Professor, Department of histology, embryology and cytology, Pirogov Russian National Research Medical University

Russian Federation, Moscow; Moscow

Evgenia N. Fedorova

Research Center of Neurology; Pirogov Russian National Research Medical University

Email: ewgenia.feodorowa2011@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2128-9056

research laboratory assistant, Neuromorphology laboratory, Brain Institute, Research Center of Neurology; assistant, Department of histology, embryology and cytology, Pirogov Russian National Research Medical University

Russian Federation, Moscow; Moscow

Alla V. Stavrovskaya

Research Center of Neurology

Email: stavrovskaya.al@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8689-0934

Cand. Sci. (Biol.), Head, Laboratory of experimental pathology of the nervous system and neuropharmacology, Brain Institute, Research Center of Neurology

Russian Federation, Moscow

Ivan A. Potapov

Research Center of Neurology

Email: potapov.i.a@neurology.ru
ORCID iD: 0000-0002-7471-3738

junior researcher, Laboratory of experimental pathology of the nervous system and neuropharmacology, Brain Institute, Research Center of Neurology

Russian Federation, Moscow

Anastasiya K. Pavlova

Research Center of Neurology

Email: pav_nastasya@mail.ru
ORCID iD: 0009-0006-5653-5524

research laboratory assistant, Laboratory of experimental pathology of the nervous system and neuropharmacology, Brain Institute, Research Center of Neurology

Russian Federation, Moscow

Vladimir S. Sukhorukov

Research Center of Neurology; Pirogov Russian National Research Medical University

Email: sukhorukov@neurology.ru
ORCID iD: 0000-0002-0552-6939

D. Sci. (Med.), Head, Laboratory of neuromorphology, Brain Institute, Research Center of Neurology; Professor, Department of histology, embryology and cytology, Pirogov Russian National Research Medical University

Russian Federation, Moscow; Moscow

References

Supplementary files