The myoprotective effect of non-quantal acetylcholine: in vitro model of the myopathy component of chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy

Cover Page


Cite item

Full Text

Abstract

Introduction. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP) is one of the most common primary polyneuropathies. A degenerative process is the underlying cause of muscular atrophy in CIDP, while muscle strength may not fully recover in patients after pathogenesis-based treatment, thus extending the period of disability. Information about factors affecting the trophic function of muscles can be used to treat neuromuscular disorders.

Study aim — to examine the trophotropic properties of the study participants' blood plasma and the myoprotective effect of acetylcholine concentration equivalent to non-quantal release, using an in vitro model of the myopathy component of CIDP.

Materials and methods. The study included 25 patients diagnosed with typical CIDP in accordance with the EFNS/PNS 2010 criteria. The control group consisted of 25 healthy individuals. Serum antibody levels to the nicotinic acetylcholine receptor were measured in all study participants. A method for organotypic cultivation of skeletal muscle tissue and an in vitro model of the myopathy component of CIPD were developed. The effect of the study participants' blood plasma on the growth of skeletal muscle explants in organotypic culture was assessed.

Results. Patients with CIPD were found to have symmetrical sensorimotor polyneuropathy of varying severity (100%); muscle atrophy (88%), and sensory ataxia (84%). The median INCAT Overall Disability Sum Score was 2 [1; 3] for the arms and 3 [2; 5] for the legs. The median Neurological Impairment Scale (NIS) score was 17 [10; 34]. The nicotinic acetylcholine receptor antibody levels were higher in patients with CIDP (0.47 [0.31; 0.54] nmol/l) than in the control group (0.02 [0.01; 0.03] nmol/l). For the first time, a myotoxic effect of the blood plasma from patients with CIDP was observed in organotypic skeletal muscle culture. Using 1:70 and 1:100 dilutions, patient blood plasma inhibited the growth of explants by 27% (n = 120; p < 0.001) and 21% (n = 120; p < 0.001), respectively. This myotoxic effect removed acetylcholine at a concentration equivalent to non-quantal release (10–8 М).

Conclusion. These results expand our understanding of skeletal muscle damage in CIPD and the role of non-quantal acetylcholine in regulating skeletal muscle growth.

Full Text

Введение

Хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия (ХВДП) — прогрессирующая или ремиттирующе-рецидивирующая иммуноопосредованная невропатия, вовлекающая в процесс моторные и сенсорные волокна (с преобладанием моторного компонента) [1]. В основе патологического процесса лежит хроническое демиелинизирующее аутоиммунное повреждение нервных волокон с вторичной аксонопатией, приводящей к денервационной мышечной атрофии [1]. Известны как функциональные, так и морфологические изменения в мышцах при ХВДП [2–4]. Так, по данным МРТ мышц, при ХВДП наблюдается значительное уменьшение объёма мышц голеней. Передняя и задняя группы мышц голени вовлекаются в дистрофический процесс в одинаковой степени, несмотря на их различную иннервацию [5]. Имеются данные о том, что в поддержание трофических свойств скелетных мышц вносит вклад холинергическая регуляция в нервно-мышечном синапсе. Ацетилхолин (АХ) — главный нейромедиатор в нервно-мышечном соединении, способный выделяться в синаптическую щель не только в квантовом виде, но и в виде «неквантовой утечки» [6]. Экспериментальные исследования показали, что АХ, выделяющийся в неквантовом виде (неквантовый АХ), повышает работоспособность непрерывно утомляемой скелетной мышцы [7–9]. Квантовый АХ, взаимодействуя с никотиновым холинорецептором, вызывает деполяризацию мышечного волокна, а также обеспечивает трофический сигнал, который предотвращает атрофию мышцы [10].

Цель исследования — изучить трофотропные свойства плазмы крови участников исследования и миопротективное действие АХ в концентрации, сопоставимой с неквантовым выбросом, на модели миопатического компонента ХВДП in vitro.

Настоящее исследование включало клиническую и экспериментальную части. Задачи клинической части: сформировать экспериментальную и контрольную группы, провести клинико-лабораторное обследование, оценить наличие антител к никотиновым холинорецепторам в плазме крови обследуемых. Задачей экспериментальной части было изучение трофических свойств плазмы крови участников исследования и миопротективного действия АХ в условиях органотипического культивирования ткани скелетной мышцы.

Материалы и методы

Характеристика обследованных больных

Под наблюдением находились 25 пациентов (14 мужчин и 11 женщин). Возраст больных составил 47–66 лет (медиана возраста 54 [50; 61] года). Все участники исследования подписали письменное информированное согласие. Всем пациентам был выставлен диагноз: ХВДП, достоверная по критериям EFNS/PNS 2010, типичная форма [11]. Контрольную группу составили 25 здоровых добровольцев (13 мужчин и 12 женщин) в возрасте 42–60 лет (медиана возраста 55 [49; 57] лет).

Методы исследования

Проводились клинико-лабораторное и экспериментальное исследования.

Клинико-лабораторное исследование включало оценку неврологического статуса, данных анамнеза и биохимическое исследование крови: уровень антител к никотиновым холинорецепторам методом иммуноферментного анализа (ИФА). Все биологические материалы взяты у пациентов до лечения.

Экспериментальное исследование было направлено на изучение миорегуляторных свойств плазмы крови в экспериментальных условиях с использованием метода органотипического культивирования ткани скелетной мышцы.

Экспериментальный метод

В качестве экспериментальных животных использовали 10–12-дневные куриные эмбрионы. Объектами исследования являлись культивируемые эксплантаты ткани скелетной мышцы бедра. Каждая серия экспериментов включала 120 контрольных эксплантатов и 120 экспериментальных эксплантатов на каждую исследованную концентрацию действующих веществ. Всего в работе исследовано 960 эксплантатов ткани скелетной мышцы.

Эмбриональную мышечную ткань препарировали на отдельные фрагменты размером 0,5–1,0 мм и помещали в чашки Петри диаметром 40 мм на коллагеновую подложку. Каждая чашка Петри содержала 15–20 эксплантатов ткани мышцы бедра. Далее чашки Петри помещали в термостат при 37ºС на 6 мин, заливали по 3 мл питательной среды, состоящей из раствора Хенкса (50% об.), среды Игла (40% об.), эмбриональной телячьей сыворотки (9,5% об.), глюкозы 40% (0,5% об.), ципрофлоксацина (2 мг/мл). Затем ставили в термостат на 30 мин, после чего добавляли плазму крови пациентов в разведении 1 : 30 об., 1 : 70 об., 1 : 100 об. В ряде экспериментов исследовали действие АХ в концентрации 10–8 М, а также действие плазмы крови пациентов в разведении 1 : 70 об. в присутствии АХ в дозе 10–8 М. Культивирование эксплантатов скелетных мышц осуществляли при 37ºС и 5% СО2 в течение 72 ч в CO2-инкубаторе («Binder»). Через 3 сут культивирования чашки Петри извлекали из CO2-инкубатора и исследовали.

Влияние плазмы крови на рост эксплантатов скелетных мышц оценивали с использованием морфометрического критерия индекса площади (ИП), который рассчитывали как отношение площади всего эксплантата к площади центральной зоны. Значение ИП контрольных эксплантатов принимали за 100%. Контрольными служили эксплантаты, развивающиеся в условиях питательной среды стандартного состава.

Статистическая обработка

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью программы «Statistica v.10.0» («StatSoft Inc.»). Данные, полученные при помощи ИФА, оценивали с использованием t-критерия Стьюдента для двух независимых выборок. При сравнении значений ИП контрольных и экспериментальных эксплантатов ткани скелетной мышцы применяли непараметрический метод статистического анализа (критерий Манна–Уитни). Множественное сравнение проводили с использованием критерия Краскела–Уоллиса.

Соблюдение этических стандартов

При проведении работы были соблюдены все международные этические стандарты проведения научных исследований с участием людей и с использованием лабораторных животных. Одобрение исследования этическим комитетом, а также утверждение формы и содержания информированного добровольного согласия на участие в исследовании было получено на заседании Локального этического комитета ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И.И. Мечникова от 22.11.2017.

Результаты

Результаты клинической части исследования

Длительность заболевания пациентов на момент осмотра составила 1–10 лет (медиана 3,5 [2, 5; 5] года). Медиана возраста дебюта заболевания — 52 [46; 60] года.

В неврологическом обследовании у больных ХВДП были выявлены следующие неврологические синдромы: полиневритический синдром с симметричными двигательными и чувствительными нарушениями в виде нижнего дистального парапареза (72%) или дистального тетрапареза (28%) различной степени выраженности; синдром мышечных атрофий (88%), представленный мышечными гипо- или атрофиями, фасцикуляциями, гипорефлексией, мышечной гипотонией; синдром сенситивной атаксии (84%). По шкале инвалидизации ODSS INCAT в руках медиана составила 2 [1; 3] балла, в ногах — 3 [2; 5] балла. По шкале невропатических нарушений (Neuropathy lmpairment Scale, NIS) медиана составила 17 [10; 34] баллов. По данным электронейромиографии у всех пациентов были выявлены достоверные электрофизиологические критерии ХВДП [11, 12].

Лабораторные результаты

Данные ИФА свидетельствуют о том, что уровень антител к никотиновым холинорецепторам в сыворотке крови больных ХВДП (0,47 [0, 31; 0, 54] нмоль/л) статистически выше, чем в контрольной группе здоровых добровольцев (0,02 [0, 01; 0, 03] нмоль/л) (р = 0,010). Уровень антител к никотиновым холинорецепторам в сыворотке крови группы контроля варьировал в интервале 0–0,09 нмоль/л, в то время как у пациентов с ХВДП — в интервале 0,1–1,8 нмоль/л.

Результаты экспериментальной части исследования

Изучали влияние плазмы крови больных ХВДП на рост эксплантатов ткани скелетной мышцы. Оценивали влияние плазмы крови в разведениях 1 : 30 об., 1 : 70 об. и 1 : 100 об. Обнаружено, что плазма пациентов в разведении 1 : 30 об. практически не влияла на рост экспериментальных эксплантатов. Плазма пациентов в разведениях 1 : 70 об. и 1 : 100 об. ингибировала рост эксплантатов ткани скелетной мышцы на 27% (n = 120; p < 0,001) и 21% (n = 120; p < 0,001) соответственно (рис. 1). Предварительно в аналогичных экспериментальных условиях оценивали влияние плазмы здоровых добровольцев. Плазма крови здоровых добровольцев ни в одном из исследованных разведений на рост эксплантатов ткани скелетной мышцы не влияла.

 

Рис. 1. Влияние плазмы крови больных ХВДП на рост эксплантатов ткани скелетной мышцы. *p < 0,001 по сравнению с контролем. / Fig. 1. The effect of blood plasma of patients with CIDP on the growth of skeletal muscle explants. *p<0.001 compared with the control group.

 

Для определения возможного вовлечения неквантовой холинергической регуляции в механизмы, препятствующие миотоксическому действию плазмы крови пациентов с ХВДП, эксплантаты скелетной мышцы культивировали в питательной среде, содержащей совместно АХ 10–8 М и плазму крови больных ХВДП в разведении 1 : 70 об. Предварительно оценивали влияние АХ (10–8 М) на рост эксплантатов исследуемой ткани. Оказалось, что АХ в дозе 10–8 М, что соответствует неквантовому выбросу, статистически значимо стимулирует рост эксплантатов ткани скелетной мышцы на 70% (n = 120; p < 0,001) по сравнению с контрольным значением (рис. 2).

 

Рис. 2. АХ в концентрации, сопоставимой с неквантовым выбросом (10–8 М), нивелирует миотоксический эффект плазмы крови больных ХВДП. *p < 0,001 по сравнению с контролем. / Fig. 2. Acetylcholine concentration equivalent to non-quantal release (10–8 М) offsets the mytotoxic effect of the blood plasma of patients with CIPD. *p < 0.001 compared with the control group.

 

Выявлено, что АХ в дозе, близкой к неквантовому выбросу, нивелирует миотоксический эффект плазмы крови пациентов. ИП экспериментальных эксплантатов значимо не отличался от контрольного значения (рис. 2).

Обсуждение

Разработанная модель миопатического компонента ХВДП in vitro позволяет оценить влияние плазмы крови пациентов с ХВДП на состояние скелетной мышцы в строго контролируемых экспериментальных условиях, исключая системные влияния со стороны организма. Важно отметить высокую степень гомологии никотинового холинорецептора в нервно-мышечном синапсе у модельных животных и человека [13, 14].

В настоящей работе в экспериментальных условиях in vitro продемонстрировано, что повреждение мышц при ХВДП может быть обусловлено не только неврогенными изменениями или атрофией от бездействия, но и миотоксическими свойствами плазмы крови. Миотоксический эффект плазмы крови пациентов с установленным диагнозом ХВДП, по-видимому, основан на наличии антител к никотиновым холинорецепторам и нивелируется АХ в концентрации, сопоставимой с неквантовым выбросом. Следует отметить, что более концентрированная плазма (1 : 30 об.) оказывала менее выраженные миотоксические свойства на культивируемую ткань. По-видимому, данное явление обусловлено наличием трофических факторов в плазме крови, частично нивелирующих токсическое действие антител к никотиновым холинорецепторам, однако это явление требует более детального изучения.

Данные, полученные на модели миопатического компонента ХВДП in vitro, свидетельствуют о том, что АХ, выделяющийся в неквантовом виде, проявляет миопротекторные свойства, препятствуя повреждению скелетной мышцы.

Квантовый выброс АХ реализуется через экзоцитоз, при котором мембрана синаптического пузырька срастается с мембраной нервного окончания с последующим выбросом фиксированного количества молекул (около 10 000) в синаптическую щель [15]. Кванты АХ способны высвобождаться из нервной терминали также в состоянии покоя, однако только несколько процентов всего АХ, выделяющегося в покое из двигательного нервного окончания, обусловлены спонтанной квантовой секрецией [16].

Впервые предположение о существовании неквантовой секреции АХ было выдвинуто J. Mitchell и соавт., продемонстрировавшими отсутствие корреляции между количеством АХ, высвобождаемого из нервно-мышечного окончания, и частотой возникновения миниатюрных потенциалов концевой пластинки при изменении температуры и концентрация калия в инкубационной среде [4]. Дополнительные эксперименты показали, что в отсутствие нервного возбуждения только небольшая часть АХ выделяется в виде квантов, в то время как основная часть нейромедиатора имеет неквантовое происхождение [17]. Предполагается, что неквантовый АХ может выполнять трофическую функцию.

После денервации мышцы неквантовое высвобождение прекращается намного раньше, чем квантовое. И наоборот, неквантовая секреция восстанавливается в ходе реиннервации раньше, чем процесс самопроизвольного квантового высвобождения [18]. Показано, что неквантовый АХ является фактором нейрогенеза, необходимым для осуществления перехода от полинейронального характера иннервации на начальных этапах эмбриональной иннервации скелетных мышц к мононейрональному [19]. В состоянии покоя часть неквантового АХ контролирует поддержание мембранного потенциала постсинаптического звена на должном уровне. Падение мембранного потенциала покоя мышечных волокон — одно из первых постденервационных изменений, и его развитие соответствует тем же временны́м рамкам, что и снижение интенсивности неквантовой утечки АХ [20]. Все вышеизложенное свидетельствует в пользу миотрофической функции неквантового АХ.

Наличие в плазме крови больных ХВДП антител к никотиновым холинорецепторам позволяет расширить стандарты лабораторной диагностики ХВДП.

В настоящее время базу лечения ХВДП составляет иммуномодулирующая терапия [12]. Полученные нами данные в экспериментальных условиях органотипического культивирования скелетной мышцы в присутствии плазмы крови больных ХВДП демонстрируют миопатические изменения мышечной ткани и позволяют обосновать расширение терапевтического подхода к лечению ХВДП, в основе которого будет лежать не только коррекция иммунопатологических изменений нервов, но и воздействие на мышечное волокно препаратами, модулирующими холинергическую регуляцию. Это позволит улучшить функциональный статус пациентов и уменьшить резидуальные явления в стадии ремиссии.

×

About the authors

Arthur V. Gavrichenko

First Saint Petersburg State Medical University; Pavlov Institute of Physiology

Author for correspondence.
Email: arthyrgavrichenko@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1286-7192

neurologist

Россия, St. Petersburg; St. Petersburg

Natalia A. Pasatetckaia

First Saint Petersburg State Medical University; Almazov National Medical Research Centre

Email: 79046449523@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8979-6460

Cand. Sci. (Biol.), Associate Professor, Department of normal physiology, junior researcher

Россия, St. Petersburg; St. Petersburg

Maria G. Sokolova

Herzen State Pedagogical University of Russia

Email: sokolova.m08@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3829-9971

D. Sci. (Med.), Associate Professor, Department of human and animal anatomy and physiology

Россия, St. Petersburg

Ekaterina V. Lopatina

First Saint Petersburg State Medical University; Pavlov Institute of Physiology

Email: evlopatina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0729-5852

D. Sci. (Biol.), Head, Department of normal physiology, leading researcher, Laboratory of physiology of cardiovascular system and lymphology

Россия, St. Petersburg; St. Petersburg

References

  1. Dyck P.J.B., Tracy J.A. History, Diagnosis, and management of chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy. Mayo Clin. Proc. 2018; 93(6): 777–793. doi: 10.1016/j.mayocp.2018.03.026
  2. Gilmore K.J., Kirk E.A., Doherty T.A. Abnormal motor unit firing rates in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. J. Neurol. Sci. 2020; 414: 116859. doi: 10.1016/j.jns.2020.116859
  3. Hokkoku K., Matsukura K., Uchida Y. Quantitative muscle ultrasound is useful for evaluating secondary axonal degeneration in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Brain Behav. 2017; 7(10): e00812. doi: 10.1002/brb3.812
  4. Markvardsen L.K., Carstens A.K.R., Knak K.L. Muscle strength and aerobic capacity in patients with CIDP one year after participation in an exercise trial. J. Neuromuscul. Dis. 2019; 6(1): 93–97. doi: 10.3233/JND-180344
  5. Gilmore K.J., Fanous J., Doherty T.J. Nerve dysfunction leads to muscle morphological abnormalities in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy assessed by MRI. Clin. Anat. 2020; 33(1): 77–84. doi: 10.1002/ca.23473
  6. Mitchell J.F., Silver A. The spontaneous release of acetylcholine from the denervated hemidiaphragm of the rat. J. Physiol. 1963; 165(1): 117–129. doi: 10.1113/jphysiol.1963.sp007046
  7. Кубасов И.В., Кривой И.И., Лопатина Е.В. Влияние экзогенного ацетилхолина на нервно-мышечную передачу утомляемой диафрагмы крысы. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1994; 118 (5): 1153–1155. Kubasov I.V., Krivoj I.I., Lopatina E.V. The effect of exogenous acetylcholine on the neuromuscular transmission of the fatigued rat diaphragm. Bull. Exp. Biol. Med. 1994; 118 (5): 1153–1155. (In Russ.)
  8. Кривой И.И., Кубасов И.В., Лопатина Е.В. Исследование восстановления работоспособности утомляемой диафрагмы крысы после применения экзогенного ацетилхолина. Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 1994; 80(9): 61–66. Krivoj I.I., Kubasov I.V., Lopatina E.V. Investigation of the restoration of the working capacity of the fatigued rat diaphragm after the use of exogenous acetylcholine. Fiziologicheskiy zhurnal im. I.M. Sechenova. 1994; 80(9): 61–66. (In Russ.)
  9. Кривой И.И., Кравцова В.В., Лопатина Е.В. Гиперполяризующий эффект ацетилхолина в скелетной мышце с различным типом мышечных волокон. Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2000; 36(24): 377–379. Krivoj I.I., Kravsova V.V., Lopatina E.V. Hyperpolarizing effect of acetylcholine in skeletal muscle with different types of muscle fibers. Zhurnal evolyutsionnoy biokhimii i fiziologii. 2000; 36(24): 377–379. (In Russ.)
  10. Cisterna B.A., Vargas A.A., Puebla C. Active acetylcholine receptors prevent the atrophy of skeletal muscles and favor reinnervation. Nat. Commun. 2020; 11(1): 1073. doi: 10.1038/s41467-019-14063-8
  11. Van den Bergh P.Y.K., Hadden R.D.M., Bouche P., Cornblath D.R. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society guideline on management of chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy: report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society — first revision. Eur. J. Neurol. 2010; 17(3): 356–363. doi: 10.1111/j.1468-1331.2009.02930.x
  12. Супонева Н.А., Наумова Е.С., Гнедовская Е.В. Хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия у взрослых: принципы диагностики и терапия первой линии. Нервно-мышечные болезни. 2016; 6(1): 44–53. Suponeva N.A., Naumova E.S., Gnedovskaya E.V. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy in adults: diagnostic approaches and first line therapy. Nervno-myshechnye bolezni. 2016; 6(1): 44–53. (In Russ.) DOI: 10.17 650/2222-8721-2016-6-1-44-53
  13. Dolly J.O., Barnard E.A. Nicotinic acetylcholine receptors: An overview. Biochem Pharmacol. 1984; 33(6): 841–858. doi: 10.1016/0006-2952(84)90437-4
  14. Lindstrom J., Criado M., Ratnam M. Using monoclonal antibodies to determine the structures of acetylcholine receptors from electric organs, muscles, and neurons. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1987; 505: 208–225. doi: 10.1111/j.1749-6632.1987.t
  15. Sudhof T.S. The synaptic vesicle cycle. Annu. Rev. Neurosci. 2004; 27: 509–547. doi: 10.1146/annurev.neuro.26.041002.131412
  16. Kuffler S.W., Yoshikami D. The number of transmitter molecules in a quantum: an estimate from iontophoretic application of acetylcholine at the neuromuscular synapse. J. Physiol. 1975; 251(2): 465–482. doi: 10.1113/jphysiol.1975.sp011103
  17. Fletcher P., Forrester T. The effect of curare on the release of acetylcholine from mammalian motor nerve terminals and an estimate of quantum content. J. Physiol. 1975; 251(1): 131–144. doi: 10.1113/jphysiol.1975.sp011084
  18. Nikolsky E.E., Oranska T.I., Vyskocil F. Non-quantal acetylcholine release in the mouse diaphragm after phrenic nerve crush and during recovery. Exp. Physiol. 1996; 81(3): 341–348. doi: 10.1113/expphysiol.1996.sp003938
  19. Vyskocil F., Vrbova G. Non-quantal release of acetylcholine affects polyneuronal innervation on developing rat muscle fibres. Eur. J. Neurosci. 1993; 5(12): 1677–1683. doi: 10.1111/j.1460-9568.1993.tb00235.x
  20. Bray J.J., Forrest J.W., Hubbard J.I. Evidence for the role of non-quantal acetylcholine in the maintenance of the membrane potential of rat skeletal muscle. J. Physiol. 1982; 326: 285–296. doi: 10.1113/jphysiol.1982.sp014192

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. The effect of blood plasma of patients with CIDP on the growth of skeletal muscle explants. *p<0.001 compared with the control group.

Download (86KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Acetylcholine concentration equivalent to non-quantal release (10–8 М) offsets the mytotoxic effect of the blood plasma of patients with CIPD. *p < 0.001 compared with the control group.

Download (55KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2022 Gavrichenko A.V., Pasatetckaia N.A., Sokolova M.G., Lopatina E.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77-83204 от 12.05.2022.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies