Structural pharmacology of GABAА receptors

Full Text

Введение

Быстрое торможение в ЦНС опосредуется активацией рецепторов γ-аминомасляной кислоты А типа (ГАМКАР). Активация ГАМКАР двумя молекулами агониста ГАМК переводит пору рецептора в открытое состояние, в котором обеспечивается энергетически оптимальный перенос ионов хлора внутрь клетки через гидрофобный барьер мембраны, что приводит к гиперполяризации мембраны и затрудняет генерацию нейронами потенциалов действия.

ГАМКАР являются мишенью для большого числа как эндогенных, так и экзогенных модуляторов, регулирующих функции этих рецепторов, в том числе широко используемых в клинической практике. К таким модуляторам можно отнести химические соединения, принадлежащие к различным классам: антиконвульсанты, анксиолитики, общие анестетики, нейростероиды, конкурентные и неконкурентные антагонисты [1, 2].

Общие сведения о структуре ГАМК_АР

ГАМКАР принадлежит к семейству цис-петельных лиганд-управляемых рецепторов, которые состоят из 5 субъединиц, симметрично (или псевдосимметрично) расположенных вокруг центральной оси и формирующих ион-проводящую пору. К этому семейству у позвоночных также относятся катион-проводящие никотиновый ацетилхолиновый и серотониновый рецепторы, анион-проводящий глициновый рецептор [3, 4].

Обнаружены 8 типов субъединиц: α1–6, β1–3, γ1–3, ρ1–3, ε, π, δ и θ, из которых может быть построен ГАМКАР [5]. Наиболее часто в ЦНС встречаются ГАМКАР, состоящие их двух α-, двух β- и одной γ- или δ-субъединицы [5, 6]. Рецепторы, содержащие γ-субъединицу, локализованы в постсинаптической мембране, где они опосредуют быстрые фазовые ответы, в то время как рецепторы, содержащие δ-субъединицу, локализованы вне синапсов и опосредуют медленные тонические токи. Синаптические и экстрасинаптические рецепторы обладают различными биофизическими свойствами, включая кинетику десенситизации, а также проявляют различные фармакологические свойства [2, 5, 7].

В целом лиганд-управляемые рецепторы могут находиться в 3 основных функциональных состояниях: закрытом, открытом и десенситизированном. Закрытый рецептор не связан с агонистом и находится в непроводящем состоянии. В отрытом агонист-связанном состоянии через пору рецептора свободно проходит ионный ток. В десенситизированном состоянии, несмотря на присутствие агониста, рецептор не проводит ионный ток и невосприимчив к новым стимулам.

В структуре ГАМКАР можно выделить экстраклеточный и трансмембранный домены (ЭКД и ТМД соответственно) (рис. 1, А, B). ЭКД каждой субъединицы включает N-концевую α-спираль, за которой следуют 10 структур типа «β-тяж–петля–β-тяж», упакованных в β-сэндвич. ТМД состоит из 4 α-спиралей (М1–М4) и различных по длине петель, соединяющих α-спирали (рис. 1, B). Пора ГАМКАР формируется 5 М2-сегментами различных субъединиц. Аминокислотный состав М2-спиралей определяет селективность и проводимость канала [8].

 

Рис. 1. Архитектура ГАМК_АР. А — вид из плоскости мембраны на 2 : 2 : 1 α1β2γ2-рецептор (6X3Z). Субъединицы выделены цветом и буквенным обозначением (α1 — сине-зеленый, β2 — оранжевый, γ2 — пурпурный цвет). B — структура отдельной субъединицы. N и С — окончания аминокислотной цепи, С-петля и цис-петля ЭКД, М₁-М₄ — трансмембранные спирали, М₂-М₃ — петля ТМД. C — вид из внутриклеточного пространства на ЭКД. Межсубъединичные интерфейсы выделены при помощи обозначений +/-. Показаны электронные плотности ГАМК и диазепама в β⁺/α^-- и α⁺/γ^--интерфейсах. D — вид из внеклеточного пространства на ТМД. Показаны трансмембранные межсубъединичные интерфейсы, в которых связываются положительные аллостерические модуляторы: β⁺/α^- — общие анестетики (этомидат — ЭТМ и пропофол — ПФЛ), бензодиазепины (диазепам — ДЗП), нейростероиды (аллопрег-нанолон — АЛП); α⁺/β^- — барбитураты (фенобарбитал — ФБЛ); β^-/γ⁺ — барбитураты (ФБЛ), бензодиазепины (ДЗП). / Fig. 1. GABA_A receptor architecture. A — view parallel to the membrane plane towards 2:2:1 α1β2γ2 receptor (6X3Z). The subunits are marked with colours and letters (α1 is blue- feen, β2 is orange, and y2 is magenta). B — structure of a single subunit. N and С — amino acid chain terminals, ECD С-loop and cys-loop, М₁-М₄ - transmembrane helices, М₂-М₃ — TMD loop. C — view from the intracellular space towards the ECD. Intersubunit interfaces are marked with +/-. The electronic densities of GABA and diazepam in β⁺/α^- and α⁺/γ^- interfaces are shown. D — view from the extra space towards the TMD. Transmembrane intersubunit interfaces to which positive allosteric modulators bind are shown: β⁺/α^- — general anaesthetics (etomidate (ETM) and propofol (PPF)), benzodiazepines (diazepam (DZP)), neuroactive steroids (allopregnanolone (ALP)); α⁺/β^- barbiturates (phenobarbital (PBT)); β^-/γ⁺ — barbiturates (PBT), benzodiazepines (DZP).

 

Каждая субъединица «соприкасается» с соседними субъединицами основной (+) и вспомогательной (–) сторонами. Система обозначений +/– используется для маркировки межсубъединичных интерфейсов рецептора. ГАМКАР имеет два β⁺/α^–-интерфейса, и по одному α⁺/β^–-, α⁺/γ^–- и γ⁺/β^–-интерфейсу (рис. 1, C, D).

Агонисты и модуляторы, связывающиеся в ЭКД ГАМК_АР

ГАМК и конкурентные антагонисты

ГАМК взаимодействуют с двумя структурно эквивалентными сайтами связывания, расположенными в β⁺/α^–-межсубъединичных интерфейсах ЭКД ГАМКАР (рис. 1, C) [9, 10]. На рис. 2, А, B показаны фрагменты криоэлектронно-микроскопических (крио-ЭМ) структур α1β2γ2-ГАМКАР со связанными ГАМК (код Protein Data Bank (PDB ID) — 6X3Z) и конкурентным антагонистом бикукуллином (PDB ID 6X3S).

 

Рис. 2. Ортостерический сайт в ЭКД со связанными ГАМК (А) и конкурентным антагонистом бикукуллином (B). Показаны боковые цепи остатков, вносящих наибольший вклад во взаимодействие с лигандом. Водородные связи и полярные контакты изображены красными пунктирными линиями. Показаны только полярные атомы водорода. C — наложение 2 крио-ЭМ-структур ГАМК_АР со связанными ГАМК (PDB ID 6X3Z) и бикукуллином (PDB ID 6X3S). ТМД и некоторые структурные элементы ЭКД α1- и β2-субъединиц не показаны для ясности. Цветовое изображение субъединиц соответствует рис. 1, при этом на фрагменте C для структуры 6X3Z использован более светлый тон. Стрелка указывает на изменение конформации С-петли. / Fig. 2. Orthosteric site in the ECD with bound GABA (А) and the competitive antagonist bicuculline (B). Side chains of the residues, which play the biggest role in ligand interaction, are demonstrated. Hydrogen bonds and polar contacts are shown as red dashed lines. Only the polar hydrogen atoms are shown. C — overlay of the two cryo-EM structures: GABA_A receptor with bound GABA (PDB ID 6X3Z) and with bicuculline (PDB ID 6X3S). The TMD and some structural elements of the ECD αl and β2 subunits are not shown for clarity purposes. The subunit colours correspond to those in Fig. 1, but a lighter shade is used for the 6X3Z structure in the C fragment. The arrow indicates the change in the C-loop conformation

 

ГАМК связывается внутри так называемой «ароматической коробочки», формируемой боковыми цепями ароматических аминокислотных остатков Phe65 (α1, петля D) и Tyr97 (β2, петля A), Tyr157 (β2, петля B), Tyr205, Phe200 (β2, петля C) (рис. 2, А). В сайте связывания формируются электростатические и катион-π взаимодействия между аминогруппой ГАМК и остатками β2-Tyr97 и Tyr205. Кроме того, карбоксильная группа ГАМК образует солевой мостик с Arg67 (α1, петля D) и водородную связь с Thr202 (β2, петля C). Таким образом, ГАМК координируется в основном за счёт гидрофильных взаимодействий в β⁺/α^–-интерфейсах ЭКД.

Несмотря на то что алкалоид растительного происхождения бикукуллин является значительно более крупной молекулой по сравнению с ГАМК, он также связывается в β⁺/α^–-интерфейсах ЭКД ГАМКАР (рис. 2, B). При этом гидрофобная природа фталидного и изохинолинового колец бикукуллина определяет характер его взаимодействий с ароматическими остатками. Фталидное кольцо бикукуллина участвует в π-стэкинг-взаимодействиях с Phe200 (β2, петля C) и стабилизирует петлю С в более открытой конформации (рис. 2, C). Наложение двух структур — 6X3Z и 6X3S — показывает, что петля С в структуре 6X3S отогнута примерно на 4,5 Å по сравнению со структурой 6X3Z.

Важно отметить, что боковые цепи остатков Arg67 (α1, петля D) и Arg120 (α1, петля E), участвующих в связывании ГАМК и стабилизации открытого состояния рецептора, изменяют свою конформацию и поворачиваются от мембраны, чтобы сайт связывания вместил более крупный антагонист. Водородная связь между остатками Arg120 (α1, петля E) и Tyr205 (β2, петля C), которая стабилизирует положение петли C в открытой конформации рецептора (рис. 2, А), разрушается при связывании бикукуллина.

Изменение положения петли C в бикукуллин-связанной структуре приводит к конформационным изменениям в β-сандвиче (петли D, CYS, F) β2-субъединицы, которые влияют на репозиционирование петли М2–М3 ТМД (рис. 1, B), что в итоге приводит к изменению конформации (из открытой в закрытую) активационных ворот ГАМКАР.

Агонисты и антагонисты бензодиазепинового сайта

Бензодиазепины (БЗД) представляют собой класс лекарственных препаратов, обладающих анксиолитическими, противосудорожными, седативными, снотворными и миорелаксантными свойствами. БЗД были введены в клиническое использование в 1960-х гг. и вскоре получили широкое распространение в качестве лекарств, назначаемых в терапевтических целях [1, 11]. Интересно, что ГАМКАР сначала был выделен как бензодиазепиновый рецептор [12, 13].

Эффективность БЗД варьирует среди ГАМКАР различного субъединичного состава [14–16]. Рецепторы, содержащие α1–3-, α5- и γ1–3-субъединицы, формируют высокоаффинный сайт связывания БЗД [15]. Более того, с селективностью по α-субъединице связаны различные клинические эффекты этих препаратов: α1-субъединица участвует в седативном и противосудорожном действии; α2 — в анксиолитическом; α2-, α3- и α5-субъединицы — в миорелаксантном; α1- и α5-субъединицы — в развитии амнезии и когнитивных нарушений [17, 18].

Структура БЗД сайта ГАМКАР хорошо охарактеризована [10, 19]. В ЭКД ГАМКАР в интерфейсе между α- и γ-субъединицами находится высокоаффинный сайт связывания БЗД. Сайты связывания БЗД с более низким сродством обнаружены также в ТМД в интерфейсах между β-и α-, а также между β- и γ-субъединицами.

В PDB представлены крио-ЭМ-структуры α1β2γ2- и α1β3γ2-ГАМКАР в комплексе с ГАМК и ДЗП: 6X3X и 6HUP соответственно [10, 19]. Конформации диазепама в α⁺/γ^–-интерфейсе ЭКД хорошо совпадают в 6X3X и 6HUP структурах. Доступны также крио-ЭМ-структуры α1β3γ2-ГАМКАР в комплексе с другим классическим БЗД алпразоламом (6HUO) и α1β2γ2-ГАМКАР в комплексе с антагонистом БЗД сайта флумазенилом (6X3U). БЗД сайт ГАМКАР в α⁺/γ^–-интерфейсе ЭКД со связанными диазепамом (6X3X) и флумазенилом (6X3U) показан на рис. 3, А, B.

 

Рис. 3. Сайт связывания БЗД α⁺/γ^--интерфейсе ЭКД. А, B — крио-ЭМ-структуры со связанными ДЗП (6X3X) и флума-зенилом (6X3U). C, D — структурные модели связывания золпидема и тиазольного аналога имидазопиридинов (соединения 37) в α⁺/γ^--интерфейсе ЭКД. Обозначения в A-D соответствуют подписям к рис. 1 и 2. / Fig. 3. BZD binding site in the ECD α⁺/γ^- interface. A, B — cryo-EM structures with bound DZP (6X3X) and flumazenil (6X3U). C, D — structural models of zolpidem and the thiazole analogue imidaz- opyridine (compound 37) binding in the ECD α⁺/γ^- interface. Labels in A-D correspond to the terms in Fig. 1 and 2.

 

Как и в ортостерическом сайте ГАМК (рис. 2, А), в сайте связывания БЗД важную роль играют ароматические остатки Phe100, His102, Tyr160, Tyr210 α1-субъединицы и Tyr58, Phe77 γ2-субъединицы (рис. 3, А). Атом хлора ДЗП является акцептором водородной связи, образуемой с остатками His102 (α1) и Asn60 (γ2). Также ДЗП выступает одновременно и донором, и акцептором водородной связи с Ser205, расположенным на изгибе C-петли α1-субъединицы (рис. 3, А). Интересно, что His102 представлен в α1-, α2-, α3- и α5-, но не в α4- и α6-субъединицах [15]. В последних 2 субъединицах эквивалентную позицию занимает аргинин, боковая цепь которого стерически препятствует связыванию классических БЗД [17, 20].

Антагонист БЗД-сайта флумазенил демонстрирует кардинально отличную от ДЗП моду связывания (рис. 3, А, B). Флумазенил имеет плоскую конформацию и связывается глубже относительно остатка γ2 Asn60, определяющего нижнюю границу БЗД-сайта. Вероятно, это связано с наличием дополнительной водородной связи с Thr142 (γ2) [19].

Классические БЗД аллостерически стабилизируют молекулу ГАМК в ортостерическом сайте связывания [10, 21, 22]. Флумазенил конкурирует с БЗД за общий сайт связывания, однако, взаимодействуя преимущественно с остатками α1-субъединицы, вызывает антагонистический эффект. J.J. Kim c соавт., изучая крио-ЭМ-структуры ГАМКАР в комплексе с ГАМК (PDB ID 6X3Z), ГАМК+ДЗП (6X3X) и ГАМК+флумазенил (6X3U), определили, что конформация 6X3X-рецептора наиболее стабильна [10, 23]. Анализ 6X3U-структуры в комплексе с использованием метода молекулярной динамики показал, что связывание флумазенила в α⁺/γ^–-интерфейсе ЭКД дестабилизирует как ЭКД, так и ТМД α1β2γ2-ГАМКАР [10]. Последнее хорошо согласуется с использованием флумазенила в клинике при передозировке как ДЗП, так и пропофола или изофлурана (связываются исключительно в ТМД) [24].

Помимо классических БЗД, α⁺/γ^–-интерфейс ЭКД является сайтом связывания также для имидазопиридинов, которые оказывают минимальное негативное влияние на когнитивные и психомоторные функции, а также вызывают меньшее привыкание у пациентов [25]. Золпидем принадлежит к соединениям этого класса и широко применяется как снотворное средство. В отличие от ДЗП золпидем обладает наибольшим сродством к ГАМКАР, содержащим α1-субъединицу, более низким сродством к α2- и α3-содержащим рецепторам и практически не взаимодействует с α5-ГАМКАР [14, 26].

Поскольку на сегодняшний день не существует крио-ЭМ- или рентгеновской структуры ГАМКАР в комплексе с золпидемом, мы использовали методику молекулярного моделирования для построения структурной модели связывания этого вещества. При помощи метода Монте-Карло минимизации [27] энергии и компьютерной программы ZMM [28–33] мы осуществили докинг и нашли энергетически оптимальную конформацию золпидема в БЗД-сайте связывания α1β2γ2-ГАМКАР (рис. 3, C) [34]. Наша модель предсказывает, что золпидем взаимодействует с остатками петель Е (Met130) и F (Glu189) γ2-субъединицы, с которыми практически не взаимодействуют классические БЗД (рис. 3, А–C). Важность остатков Met130 и Glu189 для связывания золпидема была ранее установлена в мутационных экспериментах [35, 36].

В настоящее время ведётся активный поиск новых классов модуляторов БЗД-сайта ГАМКАР, ориентированный на получение высокоактивных, малотоксичных соединений с минимальными побочными эффектами. В рамках этого направления исследований были сконструированы и испытаны в экспериментах по вытеснению меченого флунитразепама, а также в электрофизиологических экспериментах тиазольные аналоги имидазопиридинов [34]. В результате этой работы были выделены соединения-лидеры, обладающие наибольшей потенцирующей активностью. На рис. 3, D показана структурная модель связывания в α⁺/γ^–-интерфейсе ЭКД соединения-лидера 37, полученная нами при помощи метода Монте-Карло минимизации. Интересно отметить, что соединение 37, как и ДЗП, взаимодействует с остатками His102 (α1) и Asn60 (γ2) (рис. 3 А, D), а также с остатками Met130, Thr142 и Glu189 γ2-субъединицы, характерными для связывания золпидема (рис. 3, C, D).

Потенциация ГАМК_АР через межсубъединичные трансмембранные интерфейсы

Общие анестетики и барбитураты

Барбитураты начали применяться в медицинской практике ещё в начале XX в. в качестве успокаивающих и снотворных средств, однако в настоящее время их применение ограничено из-за высокой вероятности случайной передозировки, возникновения привыкания и лекарственной зависимости [37, 38]. ФБЛ является противоэпилептическим лекарственным средством, общие анестетики (ЭТМ и ПФЛ) используются в медицинской практике в качестве анестезирующих средств [37, 39].

Общие анестетики и барбитураты являются положительными аллостерическими модуляторами (ПАМ) ГАМКАР. В низких концентрациях они усиливают вызванные ГАМК токи [40–43], а в высоких концентрациях способны в отсутствие агониста активировать ГАМКАР [38, 44, 45]. Эксперименты по фотохимическому мечению [46–49], с использованием SCAMP-метода [48, 50, 51] и по направленному мутагенезу [52–55] показали, что сайты связывания этих веществ находятся в межсубъединичных интерфейсах ТМД.

Для облегчения сравнения различных субъединиц в области ТМД используется единая система обозначения остатков [56]. Высококонсервативные остатки Arg в N-терминальной части М2-спирали принимаются за позицию 0′. Далее при движении в направлении внеклеточного вестибюля канала происходит увеличение номера остатка на единицу, или уменьшение — при движении в противоположном направлении (рис. 4).

 

Рис. 4. Выравнивание аминокислотных последовательностей М₁-М₃- сегментов различных субъединиц ГАМК_АР и глицинового рецептора. Последовательности взяты из базы данных UniProt с идентификационными номерами ГАМК_А_α1 P14867, ГАМК_А_β2 P47870, ГАМК_А_β3 P28472, ГГАМК_А_γ2 PT8507, GlyR_α1 O93430, GlyR_α3 O75311. Выравнивание произведено относительно высококонсервативных остатков Arg в цитоплазматической части М₂-спиралей (0'). Цифры справа обозначают номер последнего остатка в последовательности. / Fig. 4. Alignment of the amino acid sequences of the М₁-М₃ segments in the various subunits of the GABA_A, receptor and glycine receptor. The sequences are taken from the UniProt database with the identification numbers GABA_A_αl P14867, GABA_A_β2 P47870, GABA_A_β3 P28472, GABA_A_γ2 P18507, GlyR_α1 093430 and GlyR_α3 075311. The alignment was performed relative to the highly-conserved Arg residues in the cytoplasmic part of the M2 helices (0'). The numbers on the right indicate the number of the last residue in the sequence.

 

В М1-сегменте в позиции 22′ различных субъединиц цис-петельных рецепторов (рис. 4) находится высококонсервативный остаток Pro, выше которого образуется короткий отрезок π-спирали. В ней каждый остаток связан водородной связью не с 4-м, как в α-спирали, а с 5-м по ходу спирали остатком. В результате у М1-спирали образуется изгиб, который расширяет проход из липидного бислоя в трансмембранный интерфейс в верхней (экстраклеточной) части ТМД (рис. 5, A–D). Таким образом, у ГАМКАР образуются 5 гомологичных полостей, в которых могут связываться небольшие молекулы ПАМ. Недавно были опубликованы крио-ЭМ-структуры α1β2γ2-ГАМКАР в комплексе с ЭТМ (6X3V), ПФЛ (6X3T) и ФБЛ (6X3W) [10]. ЭТМ и ПФЛ обнаружены в β⁺/α^–-, а ФБЛ — в γ⁺/β^–- и α⁺/β^–-трансмембранных интерфейсах.

 

Рис. 5. Связывание внутривенных анестетиков в ТМД. A B — ЭТМ (6X3V) и ПФЛ (6X3T) в β⁺/α^--интерфейс. C — сайты связывания ФБЛ (6X3V) в α⁺/β^-- (вверху) и β^-/γ⁺ - (внизу) интерфейсах. D — сайты связывания ДЗП (6X3X) в β⁺/α^-- (вверху) и β^-/γ⁺ - (внизу) интерфейсах. В A-D показаны только фрагменты М₁-М₃-спиралей. Обозначения в A-D соответствуют подписям к рис. 1 и 2. / Fig. 5. Intravenous anaesthetic binding in the TMD. A, B — ETM (6X3V) and PPF (6X3T) in the β⁺/α^- interface. C — binding sites of PBT (6X3V) in the α⁺/β^- (top) and the β^-/γ⁺ (bottom) interfaces. D — binding sites of DZP (6X3X) in the β⁺/α^- (top) and the β^-/γ⁺ (bottom) interfaces. A-D show only fragments of the М₁-М₃ helices. Labels in A-D correspond to the terms in Fig. 1 and 2.

 

Связывание ЭТМ исключительно в β⁺/α^–-интерфейсе подтверждается экспериментальными исследованиями [46, 52, 57]. В сайте связывания фенильное кольцо ЭТМ ориентировано в сторону ЭКД, метильная и имидазольная группы — к оси канала, а этиловый эфир — в сторону липидного бислоя (рис. 5, A). Электростатические взаимодействия формируются между амидным азотом боковой цепи остатка β2 Asn265 (15′) и π-электронами фенильного кольца ЭТМ. С остатком β2-Asn15′ связана специфичность потенцирующего эффекта ЭТМ по отношению к рецепторам, содержащим β2/3-субъединицу. Мутация Asn15′Ser (гомологичный остаток в β1-субъединице) значительно снижала, а Asn15′Met полностью устраняла потенцирующее действие ЭТМ [52]. Сильные ван-дер-Ваальсовы взаимодействия формируются с гидрофобными остатками М3-спирали β2-Phe289 (39′), Met286 (36′) и М1-спирали α1-Met236 (-19′), Pro233 (-22′).

Данные биохимических исследований указывают, что ПФЛ с различной аффинностью может связываться не только в β⁺/α^–-, но также в α⁺/β⁻- и γ⁺/β⁻-интерфейсах ГАМКАР [48, 58]. Однако в крио-ЭМ-структуре 6X3T связывание ПФЛ было обнаружено только в β⁺/α^–-интерфейсах [10]. ПФЛ формирует ван-дер-Ваальсовы контакты с гидрофобными остатками М3-спирали β2-Phe289 (39′), Met286 (36′), а также М1-спирали α1-Pro233 (-22′), Leu232 (-23′), Ile228 (-27′). ПФЛ образует водородную связь с атомом кислорода основной цепи остатка α1-Ile228 (-27′) (рис. 5, B). В отличие от ЭТМ, ПФЛ не формирует электростатических контактов с β2-Asn15′, а мутация последнего на Ser слабо влияла на его эффективность [59]. Однако мыши с внедрённой мутацией β3-Asn15′Met были нечувствительны к иммобилизирующему действию ПФЛ [60].

ФБЛ, в отличие от ЭТМ и ПФЛ, связывается в γ⁺/β^–- и α⁺/β^–-трансмембранных интерфейсах (рис. 5, C). Моды связывания ФБЛ в двух различных интерфейсах полностью совпадают, кольцо барбитуровой кислоты глубоко заходит в интерфейс, а фенильное кольцо направлено от оси канала. Сайт связывания ФБЛ гомологичен сайтам ЭТМ и ПФЛ и находится на уровне остатка M2 15′. ФБЛ стабилизирован в сайте связывания в основном за счёт ван-дер-Ваальсовых взаимодействий с гидрофобными остатками обеих субъединиц и формирует водородную связь с атомом кислорода основной цепи остатка -27′ β2-Leu223 (рис. 5, C). Гомологами остатка β2-М2-Asn15′ являются Ser270 в α1-субъединице и Ser280 в γ2-субъединице. Структурные модели связывания ФБЛ в γ⁺/β^–- и α⁺/β^–-интерфейсах предсказывают, что замещение Ser на Asn в позиции 15′ приведёт к стерическому конфликту с ФБЛ.

Общие анестетики и барбитураты сходным образом влияют на кинетику ГАМК-токов. Аппликация ЭТМ, ПФЛ и ФБЛ приводила к увеличению длительности ГАМКергических постсинаптических токов за счёт увеличения постоянной времени деактивации рецептора [44, 61, 62]. Исследования одиночных ГАМКАР показали, что эти вещества не изменяют проводимость канала, но увеличивают вероятность перехода в открытое состояние [42, 61, 63, 64].

Все рассмотренные крио-ЭМ-структуры (6X3V, 6X3T и 6X3W) соответствуют десенситизированному состоянию ГАМКАР. Они характеризуются значительным сужением поры на уровне десенситизационных ворот (диаметр кольца -2′ не превышает 3,3 Å) и значительным расширением поры (от 7,2 до 10,6 Å) на уровне активационных ворот за счёт поворота боковых цепей остатков Leu9′ от оси поры. Таким образом, можно предположить, что связывание внутривенных анестетиков в трансмембранных интерфейсах влияет на геометрию М2-спиралей и способствует переходу активационных ворот рецептора к более открытой конформации.

Бензодиазепины

Наряду с высокоаффинным сайтом связывания ДЗП в α⁺/γ^–-интерфейсе ЭКД были предсказаны низкоаффинные сайты связывания в ТМД ГАМКАР [65]. В недавно опубликованных крио-ЭМ-структурах α1β3γ2- (6HUP) и α1β2γ2- (6X3X) ГАМКАР сайты связывания ДЗП были обнаружены в β⁺/α^–- [19] и в β⁺/α^–- и γ⁺/β^–-межсубъединичных интерфейсах [10] соответственно. Сайт связывания ДЗП в β⁺/α^–-интерфейсе перекрывается с сайтами связывания общих анестетиков, а сайт связывания в γ⁺/β^–-интерфейсе перекрывается с одним из сайтов связывания барбитуратов.

Моды связывания ДЗП в структурах 6HUP и 6X3X в β⁺/α^–-межсубъединичных интерфейсах полностью совпадают, фенильное кольцо направлено к оси поры, бензольное кольцо частично заходит в интерфейс между М2- и М3-спиралями β-субъединицы (рис. 5, D). В сайте связывания ДЗП стабилизирован в основном за счёт гидрофобных взаимодействий с остатками β2/3-M3 Phe289 (39′), Met286 (36′) и α1-М1 Pro233 (-22′), Leu232 (-23′), Met236 (-19′). Интересно, что ДЗП в γ⁺/β^–-интерфейсе является энантиомером по отношению к его положению в β⁺/α^–-интерфейсе. ДЗП связывается выше остатка γ2-Ser280 (15′), фенильное кольцо направлено от оси поры и взаимодействует с остатками γ2-М3 Phe304 (39′) и β2-М1 Pro228 (-22′), а бензольное кольцо располагается рядом с М2-спиралью γ2-субъединицы (рис. 5, D).

Связывание ДЗП с 4 сайтами (1 в ЭКД и 3 в ТМД) делает открытое состояние ГАМКАР более стабильным. J.J. Kim с соавт. [10] установили, что структура ГАМКАР 6X3X (+ ГАМК, + 4ДЗП) стабильнее структуры 6X3Z (+ ГАМК) и намного более стабильна, чем структура 6X3U (+ ГАМК +флумазенил).

Интересно, что ни биохимические исследования, ни крио-ЭМ не показали возможности связывания ПАМ в α⁺/γ^–-трансмембранном межсубъединичном интерфейсе. Этот интерфейс в литературе шуточно прозвали orphan site (сирота). Предполагается, что он занят или блокирован молекулами липидов [10].

Нейроактивные стероиды

Нейростероиды представляют собой стероидные гормоны, которые синтезируются в центральной и периферической нервной системе либо de novo из холестерина, либо путём метаболизма предшественников, переносимых кровью непосредственно в нервной ткани [66]. Нейростероиды являются эффективными модуляторами как синаптических, так и экстрасинаптических ГАМКАР [67, 68]. Различные нейростероиды могут оказывать как потенцирующее, так и ингибирующее действие на ГАМКАР. Мы ограничимся в этом обзоре обсуждением механизмов действия потенцирующих нейростероидов ввиду их важности для медицинской практики.

Интерес к терапевтическим свойствам потенцирующих нейростероидов связан с возможностью их использования в качестве анестетиков, противосудорожных препаратов и для лечения некоторых неврологических и психиатрических заболеваний [69]. В последние десятилетия некоторые синтетические нейростероиды были введены в терапевтическую практику [70], а в 2019 г. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (США) одобрило использование в клинической практике нейростероида АЛП для лечения посттравматической депрессии [71].

АЛП является эндогенным ПАМ ГАМКАР. АЛП потенцировал вызванные ГАМК токи в культурах нейронов гиппокампа и спинного мозга крысы [72, 73] и при этом усиливал связывание агониста ГАМКАР ³H-мусцимола и агониста сайта БЗД ³H-флунитразепама [40, 72]. Интересно, что относительно высокие концентрации (>100 нМ) нейростероидов могут непосредственно активировать ГАМКАР в отсутствие ГАМК [67, 72].

Экспериментальные данные указывают на то, что сайт связывания нейростероидов отличается от сайтов связывания ГАМК, общих анестетиков, барбитуратов и БЗД. Эффекты, вызываемые барбитуратами и нейростероидами на связывание ³H-мусцимола или ³H-флунитразепама, являются аддитивными [40, 73]. G.D. Li с соавт. показали, что АЛП усиливает, а не подавляет фотохимическое мечение ГАМКАР ³H-азиэтомидатом [74]. Фотохимическое мечение гомо-олигомерного β3-ГАМКАР при помощи 6-азипрегнанолона выявило остаток M3-сегмента Phe301 (51′), который расположен на 4 витка спирали ниже остатка Met36′, участвующего в связывании ЭТМ [75].

В 2017 г. были опубликованы рентгеновские структуры химерных гомо-олигомерных β3-α5-ГАМКАР и GLIC-α1-ГАМКАР в связанном с нейростероидами АЛП и тетрагидродеоксикортикостероном состоянии [76, 77]. В обоих рецепторах место связывания нейростероидов оказалось в цитоплазматической части β⁺/α^–-трансмембранного интерфейса. Основываясь на этих данных, при помощи метода Монте-Карло минимизации мы построили структурную модель связывания АЛП в α1β2γ2-ГАМКАР. Наша модель предсказывает, что АЛП связывается между М1- и М3-спиралями в β⁺/α^–-межсубъединичном интерфейсе ТМД, формирует водородную связь с остатком α1-М1 Gln242 (-13′), а также образует сильные ван-дер-Ваальсовы связи с гидрофобными остатками α1-М1-Trp246 (-9′), Val243 (-14′), Ile239 (-16′) и β2-М3 Leu297 (47′), Leu301 (51′) (рис. 6, А, B).

 

Рис. 6. Связывание нейростероида АЛП в β⁺/α^–-трансмембранном межсубъединичном интерфейсе. A — полноразмерный β⁺/α^–-межсубъединичный интерфейс модели открытого α1β2γ2-ГАМК_АР, построенной по гомологии c α1-глициновым рецептором (3JAE). Показано место связывания АЛП и электронные плотности, соответствующие ГАМК (ЭКД) и ЭТМ (ТМД). B — сайт связывания АЛП в укрупнённом виде. Показаны фрагменты М₁-М₃-спиралей ТМД. Обозначения в A, B соответствуют подписям к рис. 1 и 2. / Fig.6. Binding of the neuroactive steroid ALP in the β⁺/α^–- transmembrane intersubunit interface. A — a full size β⁺/α^– intersubunit interface of an open α1β2γ2- GABA_a receptor model, based on homology with the αl glycine receptor (3JAE). The ALP binding site and the electron densities corresponding to GABA (ECD) and ETM (TMD) are shown. B — ALP binding site, magnified. Fragments of TMD М₁-М₃ helices are shown. Labels in A and B correspond to the terms in Fig. 1 and 2.

 

Как и БЗД, нейростероиды увеличивают частоту открываний одиночных каналов, а также, подобно внутривенным анестетикам, увеличивают длительность открытого состояния канала [68, 78]. Кроме того, нейростероиды увеличивают время спада ГАМКергических постсинаптических токов [79]. Поскольку АЛП связывается и взаимодействует с М1- и М3-сегментами в районе десенситизационных ворот ГАМКАР [80–82], можно предположить смещение равновесия в кинетике перехода рецептора из открытого в десенситизированное состояние в сторону открытой конформации, что должно приводить к увеличению времени жизни канала в открытом состоянии.

Заключение

Ионотропные ГАМКАР являются основной мишенью для различных групп препаратов, которые действуют как общие анестетики, анксиолитики и антиконвульсанты. Механизмы модуляции ГАМКАР этими соединениями, локализация мест их связывания на рецепторе и вызываемые ими физиологические эффекты продолжают оставаться предметом многочисленных исследований.

В обзоре рассмотрены последние достижения в понимании структуры, функций и фармакологии ГАМКАР, современные данные о молекулярных механизмах и локализации мест связывания таких клинически значимых препаратов, как БЗД, общие анестетики, барбитураты, нейростероиды и др. Представленные данные иллюстрируют, как эти фармакологические соединения взаимодействуют с ГАМКАР, модулируя его конформацию и функцию. Молекулярные взаимодействия и последующие фармакологические эффекты, вызываемые этими веществами, сложны из-за структурной гетерогенности ГАМКАР и существования многочисленных аллостерически взаимосвязанных сайтов. Выявление и характеристика различных сайтов связывания на ГАМКАР позволяет получить важную информацию для разработки фармацевтических препаратов, которые могут быть использованы для лечения широкого спектра неврологических заболеваний и психических расстройств.

About the authors

Alexey V. Rossokhin

Research Center of Neurology

Author for correspondence.
Email: alrossokhin@yahoo.com
ORCID iD: 0000-0001-7024-7461

Cand. Sci. (Phys.-Math.), leading researcher, Laboratory of functional synaptology

Россия, Moscow

Irina N. Sharonova

Research Center of Neurology

Email: alrossokhin@yahoo.com
ORCID iD: 0000-0001-9955-1870

D. Sci. (Biol.), leading researcher, Laboratory of functional synaptology

Россия, Moscow

References

Supplementary files