Expression of GABAergic and glutamatergic neurons after olfactory stimulation in the mouse piriform cortex during postnatal development

Full Text

Введение

В дополнение к известным механизмам нейрогенеза во взрослом мозге, связанным с активностью нейрогенных ниш, накапливаются экспериментальные данные о возможной роли в поддержании процессов генерации новых нейронов из активированной астроглии [1] и из нейронов с пролонгированной незрелостью. Они формируются у мышей с 11-го дня эмбрионального развития и в постнатальном периоде могут дифференцироваться до зрелых нейронов, не претерпевая пролиферации [2]. Хотя есть вероятность того, что при повреждении головного мозга эти постмитотические нейроны могут вступать в клеточный цикл и генерировать новые клетки [3], доминирует точка зрения о том, что отсутствие митотической активности позволяет дифференцировать эти клетки от DCX⁺-нейронов (нейронов, экспрессирующих даблкортин), участвующих в нейрогенезе [4].

Существуют весьма обоснованные предположения о том, что эта сохраняющаяся на протяжении всей жизни вне нейрогенных ниш популяция незрелых нейронов (non-newly generated immature neurons, nng-INs) выступает в качестве клеточного резерва, играющего существенную роль в реализации феномена нейропластичности, например, при обучении и запоминании [5]. Вместе с тем показано, что по мере развития и старения организма часть nng-INs трансформируется в глутаматергические возбуждающие нейроны, которые интегрируются в синаптические ансамбли [6] или в ГАМКергические интернейроны [7]. Пока не ясно, насколько этот процесс контролируется внешними стимулами (например, обучением) или является спонтанно реализуемым и обусловленным механизмами развития головного мозга, регулируемым нейромедиаторами, например, глутаматом и дофамином [8, 9].

В этом контексте особое внимание привлекает пириформная кора (ПК), которая представляет собой аутоассоциативную сеть, ответственную за формирование обонятельной памяти и распознавание обонятельных стимулов. Её свойства обусловлены совокупностью пирамидных нейронов, активность которых определяется глутаматергической синаптической передачей, взаимодействующих не только друг с другом, но и с клетками других регионов головного мозга [10]. Кроме того, в ПК регистрируется наличие nng-INs [11]. Показано, что nng-INs ПК могут быть ответственны у млекопитающих (например, у грызунов) за восприятие обонятельных стимулов, причём хроническая депривация обонятельных стимулов приводит к редукции числа nng-Ins в ПК [12].

Примечательно, что нарушение восприятия запахов — важный и ранний признак многих видов хронической нейродегенерации (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона), а также некоторых вирусных инфекций, протекающих с поражением головного мозга [13]. Поэтому изучение вклада nng-INs в процессы нейропластичности актуально с точки зрения изучения не только механизмов развития головного мозга, но и процессов его повреждения. Мы предположили, что nng-INs могут играть важную роль в развитии так называемого феномена раннего программирования, который может быть инициирован стрессом раннего периода жизни, что приводит к искажённой нейропластичности и повышенной вероятности развития депрессии, нейродегенерации в отдалённые периоды онтогенеза [14]. Исходя из этого реализация нашего исследования базируется на научной гипотезе, заключающейся в том, что nng-INs ПК грызунов способны трансформироваться в ГАМКергические и/или глутаматергические нейроны при действии обонятельных стимулов. При этом управление процессами выживания и дифференцировки нейронов с пролонгированной незрелостью в кортикальных зонах головного мозга важно для предупреждения развития неврологической дисфункции при нарушениях развития головного мозга и при физиологическом старении.

Целью настоящей работы стала оценка экспрессии ГАМКергических и глутаматергических нейронов после обонятельной стимуляции (ОС) в ПК мышей в динамике постнатального развития.

Материалы и методы

В эксперименте использованы мыши-самцы линии CD1 3 возрастных групп по 20 особей в группе: 2 (группа Р2), 21 (группа Р21) и 60 (группа Р60) дней постнатального развития. Животных содержали в клетках со свободным доступом к воде и корму при постоянной температуре 21 ± 1°С и регулярном световом цикле 12 ч день/12 ч ночь. Исследования на животных проводили в соответствии с соблюдением принципов гуманности, изложенных в Директиве Европейского сообщества (2010/63/ЕС).

Мышам был предъявлен однократно каскад обонятельных стимулов:

2 мин — экспозиция чистой воды

↓

1 мин — перерыв

↓

2 мин — экспозиция арахисового масла

↓

1 мин — перерыв

↓

2 мин — экспозиция арахисового масла

↓

1 мин — перерыв

↓

2 мин — экспозиция подстила из-под крыс

↓

1 мин — перерыв

↓

2 мин — экспозиция подстила из-под крыс.

Контрольная группа — интактные животные соответствующего возраста.

Через 2, 24 ч и 7 сут произведён забор тканей головного мозга для иммуногистохимического анализа, в каждой временнóй точке — 5 животных.

Забор тканей головного мозга мышей проводили под анестезией — 100–120 мг/кг хлоргидрата («Sigma-Aldrich») интраперитонеально. Фиксацию тканей головного мозга мыши осуществляли посредством транскардиальной перфузии с помощью 4% параформальдегида в забуференном фосфатом физиологическом растворе. Головной мозг извлекали, фиксировали в течение ночи в 4% параформальдегида и подвергали криозащите в фосфатно-солевом буфере, содержащем 20% сахарозы. Головной мозг разрезали на секции толщиной 50 мкм с использованием замораживающего микротома.

Оценку экспрессии молекул-маркеров — глутаматдекарбоксилазы 67 (GAD67) и везикулярного транспортёра глутамата 1 (VGlut1) — проводили на свободно плавающих срезах головного мозга согласно стандартным протоколам прямого и непрямого методов иммуногистохимии (иммунофлюоресцентный вариант). Коэкспресссию антигенов анализировали согласно стандартным протоколам одновременного или последовательного комбинированного окрашивания препарата (иммунофлюоресцентный вариант). Были использованы первичные антитела к GAD67 (ab75712, «Abcam») и VGlut1 (ab77822, «Abcam»). Вторичные антитела — антитела козы к антителам курицы, меченные Alexa 647 (ab150171, «Abcam»), ослиные антитела к антителам кролика, меченные Alexa 647 (ab150073, «Abcam»). Приготовление и иммуногистохимическую окраску свободно плавающих срезов выполняли по стандартному протоколу. В качестве финального этапа иммуногистохимической окраски во всех случаях наносили 30 мкл среды для заключения срезов (70% глицерина в фосфатно-солевом буфере + DAPI для окрашивания ядер клеток), на препарат помещали покровное стекло. Срезы, окрашенные на GAD67, VGlut1, изучали под полностью автоматизированным конфокальным лазерным сканирующим микроскопом с водной иммерсией «Olympus FV10i-W» («Olympus»). Подсчёт клеток проводили в 5 полях зрения на каждом срезе. От каждого животного было отобрано 5 срезов для анализа. Таким образом, выборка для иммуногистохимического анализа составила 25 образцов.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием методов дисперсионного анализа (однофакторный ANOVA) с последующим post-hoc тестом Бонферрони. Результаты представлены в виде M ± σ, где М — среднее значение, σ — стандартное отклонение. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05 и менее. Анализ изображений проводили с применением пакета программного обеспечения «ImageJ v.1.47».

Результаты

В динамике постнатального развития, в том числе после ОС, базальный уровень экспрессии VGlut1 и GAD67 в клетках ПК увеличивался (рис. 1), но статистически значимо не менялся в период от P2 к P60 (таблица; рис. 2).

 

Рис. 1. Экспрессия VGlut1 и GAD67 на клетках ПК животных (Р60) в группе контроля (А), экспериментальных группах через 2 ч (В), 24 ч (С) и 7 дней (D) после ОС. / Fig. 1. VGlut1 and GAD67 expression on the piriform cortex cells of animals (Р60) in the control group (А) and experimental groups, 2 hours (В), 24 hours (С) and 7 days (D) after OS.

 

Базальный уровень экспрессии VGlut1 и GAD67 (%) в клетках ПК в различные периоды онтогенеза, M ± σ / Baseline level of VGlut1 and GAD67 (%) expression in the piriform cortex cells during various ontogenetic stages, M ± σ

Группа Group	VGlut1+	GAD67+	VGlut1+GAD67+
Р2	23 ± 4	58 ± 4	16 ± 4
Р21	29 ± 3	58 ± 3	22 ± 3
Р60	31 ± 3	54 ± 2	24 ± 2

 

Рис. 2. Количество клеток (в %), экспрессирующих VGlut1 (А), GAD67 (В) и коэкспрессирующих GAD67 и VGlut1 (С) в ПК животных в группе контроля, экспериментальных группах через 2 ч, 24 ч и 7 дней после ОС. В каждой группе 5 животных, от каждого животного 5 срезов, 5 полей зрения. В выборке 25 образцов. *р < 0,01 (однофакторный ANOVA с последующим post-hoc тестом Бонферрони). / Fig. 2. Number of cells (%) expressing VGlut1 (А), GAD67 (В) and coexpressing GAD67 and VGlut1 (С) in the piriform cortex of animals in the control and experimental groups, 2 hours, 24 hours and 7 days after OS. Five animals, 5 sections from each animal, 5 fields of view in each group. The sample contained 25 specimens. *р < 0.01 (one-way ANOVA with a subsequent post-hoc Bonferroni test).

 

ОС у животных группы P2 статистически значимо увеличивает экспрессию VGlut1 в первые 2 ч после ОС (с 23 ± 4 до 38 ± 6%; р < 0,01) с последующим возвращением к исходному уровню к 7-м суткам, тогда как экспрессия GAD67 практически не изменяется (рис. 2). У животных группы P21 регистрируются однонаправленные изменения экспрессии VGlut1 (с 29 ± 3 до 41 ± 4%; р < 0,01) и GAD67 (с 58 ± 3 до 72 ± 3%; р < 0,01) увеличение через 2 ч после ОС с последующим значительным снижением (рис. 2). Очевидно, что этот эффект вряд ли обусловлен локальными изменениями активности незрелых нейронов, т.к. регистрируется независимо от изменения их количества, которое априори уменьшено в связи с зарегистрированным «физиологическим» снижением (без ОС) к 21-м суткам постнатального развития.

У животных группы P60 экспрессия обеих молекул достоверно увеличивается через 24 ч после ОС (с 54 ± 2 до 66 ± 2%), оставаясь к 7-м суткам (63 ± 2%) на таком же уровне (для GAD67) или снижаясь до исходных значений (для VGlut1: базальный уровень — 31 ± 3%; через 24 ч после ОС — 49 ± 2%; р < 0,01; через 7 дней — 32 ± 2%; рис. 2). Кроме того, по нашим данным, именно P60 характеризуется наличием важного эффекта ОС, вероятно, связанного с активностью локально представленных незрелых нейронов: к 24 ч после ОС регистрируется увеличение количества GAD67⁺- и VGlut1⁺-иммунопозитивных (коэкспрессирующих) нейронов с 25 ± 2 до 38 ± 2% (рис. 2, С).

Обсуждение

Развитие обонятельного обучения и памяти соответствует критическим периодам развития центральной нервной системы, маркирует собой некоторые ключевые механизмы пластичности головного мозга [15], в том числе в контексте инициации нейрогенеза и формирования клеток с определённым экспрессионным профилем [16], и находится в фокусе исследований вовлечённости различных регионов головного мозга в реализацию этого феномена у человека и животных [17].

В основе обучения и формирования памяти, связанной с распознаванием обонятельных стимулов грызунами, лежит вовлечение и реорганизация нейронов ПК, становящихся так называемыми клетками ассоциативной памяти, что соответствует увеличению глутаматергических влияний и подавлению ГАМКергических влияний в ПК после ОС [18]. Однако есть и альтернативная точка зрения о том, что в зрелой ПК доминируют ингибиторные эффекты, что связано не с добавлением новых ГАМКергических нейронов, а с изменением характера синаптических связей [19]. Известно, что в ПК GAD67-иммунопозитивные нейроны являются ГАМКергическими и, соответственно, ингибиторными, а VGlut1 — возбуждающими глутаматергическими [20], поэтому мы оценили соотношение двух типов клеток — GAD67/ VGlut1 — в ПК без ОС и после ОС. Мы обнаружили, что в отсутствие ОС по мере развития ПК это соотношение прогрессивно снижается от 2,6 до 1,6 (от P2 к P60), что соответствует подавлению тормозящих эффектов и увеличению влияния возбуждающих эффектов вследствие изменений в синаптической пластичности [21]. После ОС снижение этого соотношения было характерно для 2–24 ч после ОС в группе P2, а увеличение — для 7 сут после ОС в группах P21, P60. Таким образом, ОС увеличивает возбуждающие эффекты в ПК в динамике постнатального развития.

Известно, что ГАМКергические интернейроны, активируемые при ОС, генерируются в субвентрикулярной зоне и далее мигрируют до обонятельных луковиц, экспрессируя глутаматдекарбоксилазу [22]. Особенности взаимосвязи ПК с обонятельными луковицами через латеральный обонятельный тракт и наличие прямой миграции нейробластов из субвентрикулярной нейрогенной ниши в ПК [23] позволяют предполагать, что ОС у животных группы Р60, но не ранее, способствует мобилизации нейробластов субвентрикулярной зоны одновременно в ПК и в обонятельные луковицы, что также соответствует времени достижения высокого уровня пластичности в этих структурах [21]. Схожие данные были получены при изучении динамики изменения экспрессии GAD67 (но на более ранних сроках развития) во вновь образованных нейронах ПК грызунов при нахождении их в среде, обогащённой запахами, в рамках формирования модели обогащённой среды для индукции пластичности головного мозга [24]. Коль скоро обогащённая многостимульная среда рассматривается в качестве значимого фактора, увеличивающего пластичность головного мозга за счёт стимуляции процессов нейрогенеза [25], применение ОС может иметь позитивный эффект для купирования неблагоприятных последствий стресса раннего периода жизни, в том числе в контексте формирования феномена раннего программирования, увеличивающего риск нейродегенерации в отдалённые периоды онтогенеза [26].

Не менее интересны полученные нами результаты анализа коэкспрессии VGlut1 и GAD67 в клетках ПК. Известно, что совместная экспрессия VGlut1 и GAD67 может встречаться в ГАМКергических и глутаматергических нейронах, которые, по мнению ряда авторов, могут секретировать два типа нейротрансмиттеров [27–29]. Интересно, что в группах P21, P60 количество таких нейронов, коэкспрессирующих VGlut1 и GAD67, в ПК после ОС было обратным числу присутствующих nng-INs в динамике от 2 ч до 7 сут после ОС (рис. 2). Связано ли это с дифференцировкой nng-INs в клетки, способные секретировать два нейротрансмиттера, требует дополнительного изучения.

Заключение

ОС увеличивает количество ГАМКергических (GAD67⁺) и глутаматергических (VGlut1⁺) нейронов в ПК (группа P60). Преобладание глутаматергических эффектов является возможным механизмом вовлечения клеток в формирование и реализацию ассоциативной памяти.

Получены новые фундаментальные данные об особенностях активации и трансформации нейронов in vivo (оцениваемые по изменению экспрессии GAD67, VGlut1) с пролонгированной незрелостью в ГАМКергические и глутаматергические зрелые возбуждающие нейроны в контексте опыт-индуцированной нейропластичности у животных контрольной группы разных возрастных периодов.

About the authors

Yulia A. Panina

Research Institute of Molecular Medicine and Pathobiochemistry, Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Author for correspondence.
Email: annaly-nevrologii@neurology.ru
ORCID iD: 0000-0002-8675-3489

Cand. Sci. (Med.), researcher

Россия, Krasnoyarsk

Yulia A. Uspenskaya

Krasnoyarsk State Agrarian University

Email: annaly-nevrologii@neurology.ru
ORCID iD: 0000-0003-4386-9753

D. Sci. (Biol.), Associate Professor, Professor of the Institute of Applied Biotechnologies and Veterinary Medicine

Россия, Krasnoyarsk

Olga L. Lopatina

Center for collective use Molecular & Cell Technologies, Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: annaly-nevrologii@neurology.ru
ORCID iD: 0000-0002-7884-2721

D. Sci. (Biol.), Associate Professor, leading researcher

Россия, Krasnoyarsk

Alla B. Salmina

Research Institute of Molecular Medicine and Pathobiochemistry, Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University; Research Center of Neurology

Email: annaly-nevrologii@neurology.ru
ORCID iD: 0000-0003-4012-6348

D. Sci. (Med.), Prof., chief researcher, Head, Laboratory of experimental brain cytology, Department of brain sciences, chief researcher

Россия, Krasnoyarsk; Moscow

References

Supplementary files