Identification of RNA markers associated with Parkinson's disease using multiplex gene expression analysis

Full Text

Введение

Болезнь Паркинсона (БП) является вторым по частоте нейродегенеративным заболеванием в мире [1]. Его распространённость в популяции составляет 1–2 на 1000 человек, а в возрастной группе старше 60 лет — около 10 [2].

Этиология и патогенез БП изучены не в полной мере. Установлено, что у 5–10% пациентов заболевание характеризуется моногенным типом наследования и связано с мутациями в конкретных генах (их описано более 20), тогда как во всех остальных случаях патологический процесс при БП имеет сложную мультифакторную природу [3, 4]. Данному заболеванию свойственна длительная, многолетняя латентная фаза, когда на фоне уже развивающейся нейродегенерации отсутствуют типичные моторные проявления БП, которые бы давали основания предположить диагноз. При этом в момент появления самых первых моторных симптомов БП гибель дофаминергических нейронов чёрной субстанции среднего мозга, сопровождающаяся поражением нигростриарного пути, составляет уже более 50% [5].

Диагноз БП в настоящее время остаётся клиническим. Для улучшения точности диагностики разработаны соответствующие диагностические критерии [6]. Несмотря на это, на практике диагностика БП весьма непроста и требует большого опыта и настороженности врача. Точность клинической диагностики БП специалистами в области расстройств движений составляет около 80% [7]. Особенные трудности вызывает диагностика БП в начальной стадии.

Лечение БП носит симптоматический характер и предполагает приём различных препаратов для коррекции развивающегося нейротрансмиттерного дисбаланса («золотым стандартом» здесь является леводопа — биологический предшественник дофамина) и стереотаксические операции на подкорковых ядрах для «перенастройки» дисфункциональных нейросетей мозга [8]. В последние годы активно разрабатываются подходы к патогенетической терапии БП, которая бы позволила замедлить или остановить развитие нейродегенеративного процесса, но клинические исследования этих препаратов пока не увенчались успехом [9]. Возможными причинами негативных результатов нейропротективной терапии БП считают значительную клиническую и морфологическую гетерогенность заболевания, недостаточное понимание ключевых звеньев молекулярного патогенеза, трудности точной и ранней прижизненной диагностики, отсутствие объективных методов мониторинга нейродегенерации [10].

В связи с вышеуказанным большую актуальность приобретает поиск информативных биомаркеров БП, которые бы позволили установить диагноз и оценить характер прогрессирования нейродегенеративного процесса [10, 11]. В последние годы активно исследуются возможности диагностики БП с привлечением современных геномных, транскриптомных, протеомных и метаболомных подходов. Их развитие и появление новых методов анализа больших объёмов данных дало возможность выявлять характерные молекулярные профили, свойственные конкретным пациентам, создавая на этой основе диагностические мультиплексные тест-системы.

Целью данной работы явилось определение РНК-маркеров БП с помощью мультиплексного профилирования экспрессии 760 генов, ассоциированных с основными нейропатологическими процессами.

Материалы и методы

В исследование были включены 29 пациентов с диагнозом БП, установленным в соответствии с критериями Международного общества по болезни Паркинсона и расстройствам движений (2015 г.) [6]. Все обследованные дали информированное согласие на участие в исследовании и обработку персональных данных. Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБНУ НЦН (протокол заседания № 12-4/19 от 25.12.2019).

Нами были сформированы три группы обследуемых, сопоставимых по возрасту и полу (табл. 1):

1) группа с начальной стадией БП (стадии 1–2 по функциональной шкале Хен–Яра — Н-БП) — 13 пациентов, которые не получали противопаркинсоническую терапию;

2) группа с развёрнутой стадией БП (стадия 3 по шкале Хен–Яра — Р-БП) — 16 пациентов, которые более года получали противопаркинсоническую терапию препаратами леводопы;

3) группа контроля — 16 здоровых добровольцев (10 мужчин и 6 женщин), возраст — 62,0 [54, 5; 63, 5] года.

 

Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов

Table 1. Patient clinical profile

Параметр | Parameter	Группа Н-БП | Еarly PD group	Группа Р-БП | Advanced PD group
Мужчины/женщины | Men/women	8/5	10/6
Возраст, лет | Age, years	58,0 [53; 65]	62 [49; 66]
Возраст дебюта заболевания, лет | Onset age, years	55 [50; 62]	51 [41; 57]
Длительность заболевания, лет | Disease duration, years	3 [2; 4]	8 [6; 12, 5]*
Форма заболевания, n (%): | Type, n (%):
акинетико-ригидная | akinetic-rigid	2 (15,3%)	2 (12,5%)
смешанная | mixed	11 (84,7%)	14 (87,5%)
Шкала Хен–Яра, n (%): | Hoehn and Yahr scale, n (%):
I стадия | stage 1	8 (61,6%)	0*
II стадия | stage 2	5 (38,4%)	0*
III стадия | stage 3	0	16 (100%)*
Унифицированная рейтинговая шкала БП, общий балл Unified Parkinson’s Disease Rating Scale, score	39 [32; 42]	72 [61; 93]*

Примечание. *р < 0,05 по сравнению с группой Н-БП.

Note. *p < 0.05 as compared to Еarly PD group.

 

У всех пациентов определяли форму заболевания (акинетико-ригидную или смешанную) и оценивали тяжесть состояния путём расчёта суммы баллов по Унифицированной рейтинговой шкале БП (Unified Parkinson's Disease Rating Scale, UPDRS). Исследовали профиль экспрессии 760 генов, участвующих в различных нейропатологических процессах и собранных в панель «Nanostring nCounter^® Human Neuropathology Panel» («NanoString Technologies»). Данная технология позволяет в мультиплексном формате с высокой чувствительностью определять экспрессию большой совокупности генов в одном образце. Технология основана на методе «молекулярных штрихкодов», который представляет собой прямое связывание РНК с флюоресцентным зондом. Значения экспрессии выражаются в виде количества молекул, связавшихся с зондом, нормированных на концентрацию образца [12].

Из образцов периферической крови каждого обследуемого выделяли лейкоцитарную фракцию, затем тотальную РНК с помощью набора «RNeasy mini kit» («Qiagen») по стандартному протоколу производителя. В полученных образцах определяли концентрацию РНК с помощью флуориметра «DeNovix QFX Fluorimeter» согласно протоколу производителя. Далее образцы помещали в «nCounter Analysis System» («NanoString Technologies»). «Сырые» данные были обработаны с помощью пакета «nSolver v. 4.0». Данные нормировали на 10 генов «домашнего хозяйства», включённых в панель.

Статистическую обработку данных проводили в программе «SPSS Statistics v. 26» («IBM SPSS»). Нормальность распределения значений была проверена тестом Шапиро–Уилка. Для статистического анализа применяли t-критерий и ROC-анализ. Для поправки на множественные сравнения использовали подход FDR (false discovery rate), метод Бенджамини–Хохберга; статистически значимый уровень q (значение р после коррекции на множественные сравнения) принимали равным 0,05. Минимально необходимая кратность отношения величин FC (fold change) для дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ) равнялась |1,5|.

Результаты

При сравнении общей группы пациентов с БП с группой контроля выявлены различия (q < 0,05) в экспрессии двух генов: гена GTF2H1 (FC = 1,16; q = 0,02) и гена CDKN1A (FC = –1,42; q = 0,03), которые, однако, не достигли необходимого значения FC.

При сравнении данных группы Н-БП с группой контроля различия уровня экспрессии (q < 0,05) были выявлены для 3 генов: для FUS различия не достигали необходимого уровня FC (FC = –1,31, q = 0,03), тогда как гены CDKN1A и CPT1B подходили под критерии ДЭГ (табл. 2).

 

Таблица 2. ДЭГ нейропатологии в группе пациентов с Н-БП и в контрольной группе

Table 2. Differentially expressed neuropathology genes in the early PD group and in the control group

Ген Gene	Н-БП Early PD group	Kонтроль Control	FC	p	q
CDKN1A	47,2 ± 13,4	80,6 ± 19,6	–1,59	0,0002	0,01
CPT1B	36,4 ± 13,5	56,1 ± 16,8	–1,65	0,0004	0,01

 

Проведённый ROC-анализ показал хорошую диагностическую значимость для обоих выявленных генов. Для гена CDKN1A площадь под AUC-кривой составила 0,87, для гена CPT1B — 0,81.

При сопоставлении уровней экспрессии генов в группе Р-БП и в контрольной группе выявлено повышение экспрессии гена LRP1 (табл. 3). По результатам ROC-анализа AUC для данного гена составила 0,89, что свидетельствует о хорошей диагностической значимости.

 

Таблица 3. ДЭГ LRP1 в группе Р-БП и в контрольной группе

Table 3. Differentially expressed LRP1 gene in the advanced PD group and the control group

Ген Gene	Р-БП Advanced PD group	Kонтроль Control	FC	p	q
LRP1	118,04 ± 34,75	69,57 ± 27,36	1,7	0,0004	0,01

 

При сравнении ранних и развёрнутых стадий БП, т.е. групп Н-БП и П-БП, выявлены различия в экспрессии гена СPT1B: уровень экспрессии в группе Н-БП составил 36,4 ± 13,5, в группе Р-БП — 64,8 ± 40,1 (FC = 1,78; q = 0,01).

В общей группе БП возраст начала заболевания и возраст на момент обследования не был ассоциирован с экспрессией ни одного из исследуемых генов. При этом выявлена статистически значимая связь уровня экспрессии гена CPT1B с длительностью заболевания (R = 0,639; q < 0,05; рисунок).

 

Корреляция уровня экспрессии гена CPT1B с длительностью БП.

Correlation between the CPT1B expression level and PD duration.

 

Профиль экспрессии генов при акинетико-ригидной и смешанной формах БП, оценённый во всей когорте обследованных пациентов, не различался (для гена USP21 FC = –1,4, что не соответствует критериям ДЭГ; q < 0,001).

Исследована связь профиля экспрессии генов нейропатологии с тяжестью заболевания, оцениваемой по шкалам Хен–Яр и UPDRS. Проведённый анализ выявил первичную корреляцию экспрессии гена CPT1B со стадией заболевания по шкале Хен–Яр, однако после поправки на множественные сравнения эта корреляция оказалась статистически незначимой (R = 0,6; p < 0,001; q > 0,05). Корреляций между экспрессией генов нейропатологии и суммой баллов по шкале UPDRS не выявлено.

Обсуждение

Изменение экспрессии генов играет важную роль в развитии нейродегенеративных заболеваний. Множество исследований, посвящённых патогенезу различных форм нейродегенеративной патологии, с проведением сложного биоинформатического анализа не выявляют какого-то одного, критического звена в их развитии и говорят о перестройках целых ансамблей различных РНК [13]. Изменения на уровне сетей РНК следует рассматривать как интегральный маркер процессов, происходящих в организме при развитии многофакторного заболевания. Изменения на уровне транскриптома могут происходить по разным причинам, например, непосредственно связанным с текущей нейродегенерацией, её клиническими проявлениями, медикаментозной терапией и т.д. Работ, посвящённых мультиплексному исследованию экспрессии генов и изучению транскриптома при БП, немного, а результаты их существенно разнятся.

В многоэтапном исследовании J.A. Santiago и соавт. выявлены 7 генов, которые имеют отличия в экспрессии в цельной крови при БП по сравнению с контролем: FAXDC2 (C5ORF4), COPZ1, MACF1, WLS, PRG3, ZNF160 и EFTUD2. Однако в процессе последующего более детального анализа отличия в экспрессии этих генов не достигли уровня статистической значимости [14]. В работе R. Shamir и соавт., посвящённой транскриптомному исследованию цельной крови при БП, обнаружены 64 гена с повышенной экспрессией и 23 гена со сниженной экспрессией у пациентов по сравнению с контрольной группой [15]. В транскриптомном исследовании С.R. Scherzer и соавт. указаны 22 гена, экспрессия которых в клеточной фракции крови значимо меняется при БП [16]. При анализе экспрессии генов в эритроцитах пациентов с БП с использованием панели Nanostring и последующим подтверждением результатов с помощью цифровой полимеразной цепной реакции выявлено снижение экспрессии гена CHCHD2 [17].

В нашем исследовании также была использована панель Nanostring, содержащая 760 генов, ассоциированных с различными нейропатологическими процессами. Одними из основных преимуществ данной платформы являются возможность единовременного измерения экспрессии сотен генов в одной реакции и высокая чувствительность метода. Для исключения ложноположительных результатов в мультиплексной реакции мы применили в своей работе достаточно «жёсткие» критерии отбора ДЭГ.

В работе сравнивалась общая группа пациентов с БП с контрольной группой. Однако сравнительный анализ не выявил статистически значимых ДЭГ, возможно, в связи с гетерогенностью собранной выборки — наличием ранних и поздних стадий БП, разбросом значений длительности заболевания, тяжести состояния, наличием противопаркинсонической терапии у части пациентов. Вероятно, именно гетерогенность выборки не позволила выявить общие маркеры собственно БП, характеризующие все стадии нейродегенеративного процесса.

Больший интерес представляют выявленные изменения экспрессии генов на ранних стадиях БП, т.к. именно они являются наиболее сложными в диагностическом плане. Сравнительный анализ в нашей работе выявил достоверное снижение экспрессии генов CDKN1A и CPT1B в группе Н-БП по сравнению с контролем.

CDKN1A является ингибитором циклинзависимых киназ и играет ключевую роль в регуляции клеточного цикла. Большинство проведённых ранее исследований было посвящено роли CDKN1A в развитии опухолей, однако показано его участие и в процессах нейродегенерации [18, 19]. Исследований вовлечения данного белка в патогенез БП чрезвычайно мало. В одной из работ выявлено, что уровень мРНК CDKN1A повышался в ранние сроки (через 5 ч) после инъекции нейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6- тетрагидропиридина (МРТР), вызывающего БП, в стриатуме экспериментальных мышей [20]. Однако клиническое значение данного маркера для БП в проведённых до настоящего времени других исследованиях не описано. В нашей работе мы впервые продемонстрировали возможное значение экспрессии этого гена в качестве перспективного диагностического биомаркера у пациентов с БП, а участие в ключевых клеточных процессах указывает на его потенциальную роль в патогенезе нейродегенерации.

Ген LRP1 показал дифференциальную экспрессию при развёрнутых стадиях БП по сравнению с контрольной группой. LRP1 — белок, ассоциированный с рецептором липопротеидов низкой плотности. Он является нейрональным белком, осуществляющим захват ApoE, а также рецепторным белком для бета-амилоида, участвующего в патогенезе болезни Альцгеймера [21]. Экспрессия LRP1 повышается в нейронах чёрной субстанции на ранних стадиях БП [22].

Третий ДЭГ, выявленный в настоящем исследовании, — CPT1B. Одноимённый белок CPT1B, кодируемый данным геном, регулирует бета-окисление в митохондриях [23]. Известно, что митохондриальная дисфункция является одним из основных звеньев патогенеза БП. Ряд генов, ассоциированных с наследственными формами первичного паркинсонизма, влияют на функцию митохондрий [24]. Кроме того, с развитием заболевания связаны накопление митохондриальных мутаций и число копий митохондриальной ДНК [25].

Есть предположение, что ключевой белок молекулярного патогенеза БП α-синуклеин, в норме присутствующий в митохондриях, при олигомеризации вызывает снижение активности комплекса I и оксидативный стресс [26]. Не случайно у пациентов с БП снижена активность митохондриального комплекса I дыхательной цепи [27, 28]. Установлено также, что связывание α-синуклеина с митохондриальной мембраной ведёт к её разрушению [29]. В целом, митохондриальная дисфункция и накопление α-синуклеина при БП — это взаимосвязанные процессы. Следовательно, выявленное нами снижение экспрессии «митохондриального» гена CPT1B у пациентов на начальных стадиях БП может подтверждать, что митохондриальная дисфункция служит одним из основных звеньев патогенеза заболевания.

Если на начальных стадиях БП выявляется сниженная экспрессия CPT1B, то, согласно нашим предварительным данным, на развёрнутых стадиях она повышается. В работе установлены корреляция экспрессии CPT1B с длительностью болезни, а также его повышенный уровень в группе Р-БП по сравнению с группой Н-БП (группы статистически значимо различались по длительности заболевания, и указанные особенности экспрессии CPT1B, вероятно, могут быть связаны именно с этим). Имелась также тенденция к корреляции между уровнем экспрессии CPT1B и тяжестью заболевания по шкале Хен–Яр, не достигавшая статистической значимости после поправки на множественные сравнения. Учитывая выявленные ассоциации, данный ген заслуживает внимания как потенциальный биомаркер прогрессирования БП.

Разработка маркеров не только для диагностики, но и для оценки прогрессирования заболевания — немаловажный аспект, который в перспективе позволит проводить мониторинг клинического эффекта, достигаемого на фоне приёма препаратов для патогенетического лечения БП. Нейродегенеративные заболевания развиваются медленно на протяжении многих лет, и для чёткой верификации замедления прогрессирования заболевания на фоне терапии требуется достаточно продолжительное время. Разработка информативных суррогатных биомаркеров прогрессирования заболевания позволит ускорить оценку эффективности новых нейропротективных препаратов. По такому принципу проходили первые фазы исследования препаратов для патогенетического лечения болезни Альцгеймера [30]. Выявленные в нашей работе транскриптомные биомаркеры БП требуют дальнейшей оценки, в том числе у одних и тех же пациентов в динамике.

Ограничения исследования. Оценивалась малая выборка пациентов при большом количестве изучаемых генов, и для «компенсации» указанного ограничения использована максимально жёсткая статистическая обработка результатов с применением поправки на множественные значения и порогом для параметра FC. Методика исследования не является «золотым стандартом» для количественной оценки экспрессии генов, в связи с чем представленные результаты следует рассматривать в качестве предварительных. Необходимы дальнейшие валидационные исследования полученных данных, в том числе на больших выборках.

Источник финансирования. Работа поддержана грантом РНФ № 19-15-00320.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

About the authors

Natalia S. Ardashirova

Research Center of Neurology

Email: ardashirova.n@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4813-9912

PhD student, Neurogenetic department

Россия, 125367, Moscow, Volokolamskoye shosse, 80

Natalia Yu. Abramycheva

Research Center of Neurology

Email: nataabr@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0001-9419-1159

Cand. Sci. (Biol.), leading researcher, Head, DNA laboratory, Neurogenetic department

Россия, 125367, Moscow, Volokolamskoye shosse, 80

Ekaterina Yu. Fedotova

Research Center of Neurology

Email: ekfedotova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8070-7644

D. Sci. (Med.), Head, Neurogenetic department

Россия, 125367, Moscow, Volokolamskoye shosse, 80

Vladimir S. Sukhorukov

Research Center of Neurology

Email: vsukhorukov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0552-6939

D. Sci. (Med.), Prof., Head, Neuromorphology laboratory

Россия, 125367, Moscow, Volokolamskoye shosse, 80

Anastasiya S. Voronkova

Research Center of Neurology

Email: anast.voronkova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5788-5178

Cand. Sci. (Biol.)

Россия, 125367, Moscow, Volokolamskoye shosse, 80

Natalia M. Mudzhiri

Research Center of Neurology

Email: Mudzhirinm@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3835-6622

junior researcher, Neuromorphology laboratory

Россия, 125367, Moscow, Volokolamskoye shosse, 80

Sergey N. Illarioshkin

Research Center of Neurology

Author for correspondence.
Email: ardashirova.n@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2704-6282

D. Sci. (Med.), Prof., RAS Full Member, Deputy Director for Science; Director, Brain Institute

Россия, 125367, Moscow, Volokolamskoye shosse, 80

References

Supplementary files