Сравнительный анализ нейрогенеза и церебрального ангиогенеза в нейрогенной нише гиппокампа у животных с двумя моделями экспериментальной болезни Альцгеймера

Полный текст

Введение

Способность головного мозга реагировать на внутренние или внешние раздражители путём реорганизации своей структуры, функций и связей характеризуется его пластичностью [1]. Этот феномен играет ключевую роль в формировании и сохранении нейронных схем и когнитивных функций. В то время как нормальная нейропластичность важна для функционирования мозга, её нарушения являются основой для развития нейродегенеративных заболеваний. Болезнь Альцгеймера (БА) характеризуется ускоренным старением мозга, аберрантной пластичностью, что ассоциировано с постепенной дегенерацией нейронов и формированием амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков в головном мозге. Несмотря на огромные исследовательские усилия, патогенез БА по-прежнему не изучен, а несколько ключевых теорий возникновения этого заболевания — амилоидная, кальциевая и пр. — конкурируют друг с другом [2].

Изучение механизмов развития БА в последние несколько декад осуществляется с использованием разнообразных моделей на животных: с введением нейротоксических агентов (колхицин, скополамин, атропин, соли алюминия) или олигомеров β-амилоида в ткань мозга; на трансгенных животных, несущих мутации в 3 или 5 генах, кодирующих белки, связанные с развитием нейродегенерации альцгеймеровского типа (белок-предшественник амилоида, пресенилин, тау-белок), а также животных, имеющих индуцированные дисметаболические нарушения, характерные для БА (инсулинорезистентность, митохондриальная дисфункция) [3].

Каждая из этих моделей имеет свои достоинства и ограничения, что определяет разную степень их пригодности к проведению доклинических и трансляционных исследований, в том числе при разработке методов фармакотерапии [4]. Это ставит исследователей перед вопросом применимости той или иной модели для оценки ключевых механизмов нейродегенерации и сопоставимости полученных результатов [5].

Например, у мышей линии 5xFAD значительная гибель нейронов развивается в возрасте 9–12 мес, а аккумуляция β-амилоида в ткани мозга и нейровоспаление регистрируются уже в возрасте 1,5–2,0 мес [6], тогда как введение в ткань мозга (желудочки, гиппокамп) различных вариантов β-амилоида (1–40, 1–42, 25–35) приводит к достаточно быстрому (в течение 3 дней) развитию нейровоспаления, повреждению микрососудов и формированию когнитивного дефицита, что особенно ярко проявляется при введении β-амилоида старым животным [7].

Подавление процессов нейрогенеза в нейрогенных нишах у животных с triple model (3xTg) наблюдается на ранних этапах постнатального онтогенеза (1–2 мес после рождения) и до формирования когнитивной дисфункции [7], у животных линии 5xFAD, характеризующихся нарастающим распространением в ткани мозга (начиная с subiculum и далее в гиппокамп и кору) признаков дистрофии нейритов, глиоза и аккумуляции β-амилоида) [8], подавление нейрогенеза очевидно к 2 мес постнатального развития, а у некоторых трансгенных животных с другими моделями БА регистрируется парадоксальная интенсификация нейрогенеза на 2–3-м месяцах постнатального онтогенеза [9]. Как мы показали ранее, у животных с интрагиппокампальным введением β-амилоида уже на 9-е сутки регистрируется увеличение экспрессии Pax6 и Nestin в субгранулярной зоне гиппокампа [10], а последующее снижение эффективности нейрогенеза носит длительный характер [11] и сопровождается прогрессированием локального нейровоспаления [12].

В этом контексте изучение механизмов аберрантной пластичности при БА должно основываться на понимании особенностей реализации патогенетических механизмов повреждения мозга у животных с разными моделями нейродегенерации, но выявление общих закономерностей, присущих всем (или большинству) релевантным моделям, особенно важно для корректной интерпретации полученных данных.

Нейрогенные ниши головного мозга, в частности субгранулярная зона (СГЗ) гиппокампа, являются интересным и информативным объектом для изучения нейропластичности, в том числе при прогрессирующей нейродегенерации. Во-первых, изменения нейрогенеза в гиппокампе напрямую связаны с когнитивными функциями, например, за счёт механизмов регуляции количества энграм-клеток или регуляции баланса «возбуждение/торможение» в гиппокампе [13]. Во-вторых, изменения нейрогенеза в гиппокампе отчётливо регистрируются при обучении и запоминании [14]. В-третьих, именно гиппокамп является одной из наиболее аффектированных областей мозга при БА [15]. В-четвертых, долгосрочные механизмы пластичности, определяемые эффективностью нейрогенеза, должны подкрепляться в гиппокампе изменениями локальной микроциркуляции и ремоделированием микрососудистого русла, например, за счёт механизмов неоангиогенеза и регрессии микрососудов [16]. В частности, в СГЗ гиппокампа, в отличие от субвентрикулярной зоны (СВЗ) гиппокампа, ангиогенная активность a priori высока, причём группы пролиферирующих клеток эндотелия находятся в непосредственном контакте с нейральными стволовыми клетками и высоко чувствительны к действию регуляторных молекул локального микроокружения [16]. Таким образом, в дополнение к механизмам нейрогенеза, характеризующим долговременные механизмы опыт-индуцированной пластичности [17], оценка ремоделирования микрокапиллярного русла в этой нейрогенной нише может быть информативной для анализа пластического потенциала мозга в норме и при нейродегенерации.

Целью нашего исследования стала сравнительная оценка изменений нейрогенеза и ремоделирования микрососудов в СГЗ гиппокампа мышей с двумя экспериментальными моделями БА: интрагиппокампальное введение β-амилоида и трансгенные животные линии 5xFAD.

Материалы и методы

Дизайн исследований представлен на рис. 1.

 

Рис. 1. Общая схема дизайна экспериментов in vivo с использованием двух моделей БА. 
Модель 1 — животные с интрагиппокампальным введением Aβ_25–35 (контроль — ложнооперированные животные с введением 0,9% раствора NaCl); модель 2 — животные линии 5xFAD (контроль — интактные мыши линии C57BL/6).

 

Нами были использованы две модели БА in vivo.

Первая модель — животные с интрагиппокампальным введением фрагмента β-амилоидного белка Aβ_25–35. Мышам-самцам C57BL/6 в возрасте 6 мес и массой 30–35 г (n = 39) была проведена стереотаксическая операция. Для анестезии использовали Золетил-100 («Virbac Sante Animale») и Ксила («Interchemie Werken “de Adelaar” BV»). Стандартный раствор Золетила-100 (500 мг в 5 мл) с физиологическим раствором в соотношении 1 : 4 вводили внутримышечно из расчёта 1,5 мг активного вещества на 25 г веса мыши. Ксила также разводили физиологическим раствором в соотношении 1 : 2 и вводили внутримышечно из расчёта 0,6 мг на 25 г веса мыши. Животным, находящимся под наркозом, с 2 сторон просверливали отверстия в черепе с помощью манипулятора («Stoelting») в соответствии с координатами «Mouse Brain Atlas» (AP — 2.0; ML — 1.9; DV — 1.3). Затем в область СА1 гиппокампа вводили 2 мкл 1 мм раствора олигомеризованного Aβ_25–35 («Sigma-Aldrich Co.») в 0,9% растворе NaCl. Раствор Aβ_25–35 готовили в соответствии с инструкциями производителя: Aβ_{25 -35} растворяли в 1 мл 0,9% раствора NaCl и инкубировали при 37°С в течение 4 дней). Животным контрольной группы — ложнооперированным (ЛО; 6 мес; n = 34) — вводили 0,9% раствор NaCl в том же объёме по соответствующим координатам.

В качестве второй экспериментальной модели БА in vivo использовали 6-месячных лабораторных мышей-самцов линии 5xFAD, B6SLJ-Tg(APPSWFLON,PSEN1M146LL286V)6799Vas (n = 21). Контрольная группа — интактные мыши-самцы C57BL/6 (6 мес; n = 21).

Все эксперименты проводили в соответствии с принципами гуманного обращения с животными и Директивой ЕС 2010/63/EU об экспериментах на животных. Животных содержали в клетках (не более 6 особей в клетке) с неограниченным доступом к пище и воде, 12-часовым ежедневным освещением. Исследования выполнены в соответствии с разрешением Локального этического комитета Российского центра неврологии и нейронаук (протокол № 5-3/22 от 01.06.2022).

Тест «Условно-рефлекторное пассивное избегание» (УРПИ). Когнитивные нарушения оценивали с помощью теста УРПИ в соответствии со стандартным протоколом на 1-й день после действия неизбегаемого аверсивного стимула (электрический ток 0,2 мА, 3 с через металлическую решетку пола после входа в тёмный отсек), а также на 7-й и 28-й дни после тренировки. Учитывали время, которое потребовалось мыши, чтобы переместиться из освещённого отсека камеры в тёмный отсек.

Оценка пролиферации клеток нейрональной и эндотелиальной природы в нейрогенной нише гиппокампа. Животным внутрибрюшинно вводили раствор BrdU (50 мг/кг массы тела) через 1 ч после обучающего стимула — аверсивного раздражителя, затем выполняли по 1 инъекции BrdU каждые 24 ч в течение 2 дней [18].

Иммуноокрашивание. В разные временны́е точки (7-е и 28-е сутки после обучения в тесте УРПИ) по 8 животных из каждой изучаемой группы умерщвляли методом смещения шейных позвонков. Мозг животного фиксировали в 4% параформальдегиде («Wuhan Servicebio Co., Ltd»), а затем готовили криосрезы толщиной 10 мкм с использованием криотома «FS800A» («RWD»). Сагиттальные срезы предварительно промывали в фосфатно-солевом растворе («Росмедбио») в течение 10 мин, а затем в течение 60 мин в 0,1% растворе Triton X-100 («Calbiochem Biochemicals») с добавлением 5% бычьего сывороточного альбумина («BioFroxx») для блокирования неспецифического связывания и окрашивали антителами. Антитела были подобраны в соответствии с видовой специфичностью и применялись в соответствии с протоколами, рекомендованными производителем: первичные антитела — anti-BrdU (Host–Mouse, 1 : 100, A1482, «ABClonal»); первично-меченые кроличьи антитела — anti-NeuN (1 : 100, FNab05669, «FineTest»); anti-CXCR4 (1 : 250, AF5279-F555, «Affinity»); anti-DLL4 (1 : 250, DF13221-F250, «Affinity»); anti-VEGFR2 (1 : 250, AF6281-F488, «Affinity»); anti-CD31 (1 : 250, AF6191-F555, «Affinity»); anti-TIE1 (1 : 250, AF4582-F555, «Affinity»); anti-Ki-67 (1 : 250, AF0198-F350, «Affinity»); anti-Notch (1 : 250, AF5307-F488, «Affinity»); вторичные антитела — anti-Rabbit (1 : 100, AS011, «ABClonal»); anti-Mouse (1 : 500, ab150116, Abcam, Великобритания). Срезы были покрыты защитными стёклами с использованием монтажной среды с эффектом сохранения флуоресценции «Fluoroshield Mounting with DAPI» («Sigma Aldrich»).

Для оценки пролиферации клеток в СГЗ с использованием BrdU готовили сагиттальные срезы головного мозга толщиной 26 мкм и учитывали количество BrdU⁺NeuN⁺DAPI⁺- и BrdU⁺CD31⁺DAPI⁺-клеток. При таком способе оценки показывает популяцию потомков пролиферирующих NSCs/NPCs или клеток эндотелия соответственно, активированных на 1-е сутки эксперимента (обучение) [18].

Цифровые изображения были получены с помощью системы визуализации EVOS M7000 («Thermo Fisher Scientific») и обработаны в программе «ImageJ» с использованием плагина для подсчёта флуоресцентных меток на микрофотографиях. Уровень экспрессии этих маркеров характеризовали количеством окрашенных клеток, нормализованным на 100 DAPI⁺-клеток в СГЗ.

Оценка ветвления и плотности сосудистой сети в гиппокампе. Через 1 ч после УРПИ (10-е сутки эксперимента) в соответствии со стандартным протоколом мышам внутрисердечно вводили 2% раствор Evans Blue (6 мкл/г массы тела) [19]. Через 5 мин животное подвергалось эвтаназии, у него извлекали головной мозг, в тонких срезах которого осуществляли анализ ангиогенеза. Для этого использовали микрофотографии, полученные при микроскопии срезов в программе «ImageJ»: фотографии переводили в бинарное изображение, очищали от фона («Threshold»), проводили скелетизацию изображения («Skeletonize»); для количественной оценки скелетированных изображений применяли «Analyze skeleton» (метод «Shortest branch») и плагин «Vessel Analysis» (вариант «Vascular Density»). Результаты выражали в абсолютных значениях для оценки количества узлов ветвления сосудов в зоне интереса, а для характеристики плотности сосудистой сети — в виде отношения длины сосуда на единицу площади.

Статистический анализ. Для статистической обработки данных использовали программу «Statistica v. 13.3» («СтатСофт»). Заключение о нормальности распределения данных основано на критериях Колмогорова–Смирнова и Шапиро–Уилка. Результаты были обработаны с использованием U-критерия Манна–Уитни. Результаты считали значимыми при p < 0,05. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения.

Результаты

Механизмы пластичности мозга тесно сопряжены с такими процессами, как нейрогенез и церебральный ангиогенез, и характеризуются значимыми изменениями при прогрессирующей нейродегенерации [19]. Пластичность, связанная с развитием головного мозга или приобретённым опытом, а также адаптивная пластичность, свойственная повреждённому головному мозгу, вероятно, могут по-разному влиять на процессы ангиогенеза и нейрогенеза [20]. Для оценки параметров нейрогенеза и ангиогенеза при опыт-индуцированной пластичности в обеих моделях БА нами был применён аверсивный неизбегаемый раздражитель в качестве обучающего стимула. Мы обнаружили, что животные с обеими моделями демонстрируют схожую динамику в развитии когнитивной дисфункции к 28-му дню после 1-го сеанса обучения (рис. 2), что соответствует полученным ранее результатам с использованием модели, индуцированной интрагиппокампальным введением β-амилоида [21]. В частности, наблюдается устойчивая тенденция к уменьшению времени перехода в тёмный отсек камеры в тесте УРПИ у мышей с введением Aβ_{25 -35} на 92 с и на 113 с у мышей 5xFAD по сравнению с контрольными группами (р = 0,0449).

 

Рис. 2. Результаты нейроповеденческого тестирования в тесте УРПИ ЛО-животных и животных с интрагиппокампальным введением Aβ25–35 (А), интактных и трансгенных животных линии 5xFAD (В) на 7-й и 28-й дни после обучения.

 

Как мы предполагали ранее [21], развитие когнитивного дефицита к 28-м суткам после 1-й обучающей сессии может соответствовать изменению процессов гиппокампального нейрогенеза, так как полный цикл от рекрутинга нейральных стволовых клеток до формирования популяции молодых нейронов составляет у млекопитающих около 4 нед [22]. Поэтому далее мы оценили количество пролиферирующих клеток нейрональной природы, чьё вступление в митоз было инициировано во время 1-й обучающей сессии.

Мы обнаружили, что количество молодых BrdU⁺-нейронов у животных с интрагиппокампальным введением Aβ_25–35 на 7-е сутки после применения аверсивного раздражителя было повышено (на 52% больше, чем в контрольной группе; р = 0,0449) и ещё больше увеличилось к 28-му дню (рис. 3). В то же время количество BrDU⁺-клеток нейрональной природы у животных линии 5xFAD к 7-м суткам было существенно ниже, чем у животных обеих контрольных групп и животных с интрагиппокампальным введением β-амилоида и далее увеличивалось, но не достигало значений, характерных для животных с нейродегенерацией, индуцированной интрагиппокампальным введением β-амилоида (рис. 3). У трансгенных животных на 7-й день после когнитивного стимула признаки усиленного нейрогенеза в СГЗ (рис. 3) не были зафиксированы, а усиленная пролиферация клеток нейрональной природы наблюдалась только к 28-му дню (в 3,75 раза; р = 0,0450), возможно, из-за несоответствия между запросом на нейрогенез и неспособностью реализовать механизмы пластичности.

 

Рис. 3. Изменение количества BrdU⁺-нейронов (NeuN⁺) в СГЗ ЛО и животных с интрагиппокампальным введением Aβ25–35 (А), интактных и трансгенных животных линии 5xFAD (В) на 7-й и 28-й дни после обучения.

 

Данные нормализованы на 100 DAPI⁺-клеток и представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения.

 

В целом, после обучения животные после интрагиппокампального введения Aβ_25–35 демонстрировали усиленный нейрогенез, в отличие от животных 5xFAD, у которых пролиферация нейрональных клеток носила замедленный и менее выраженный характер, возможно, из-за длительного — начиная с периода эмбриогенеза — процесса нейродегенерации и истощения пула нейральных стволовых и нейрональных прогениторных клеток.

Когнитивный резерв зависит от адекватного нейроваскулярного сопряжения, состояния микроциркуляции в активных регионах головного мозга, а васкуляризация гиппокампа существенно модулирует когнитивную производительность [23, 24]. Поэтому далее мы проанализировали изменения локального ангиогенеза в нейрогенной нише головного мозга. Как и в случае с оценкой BrdU⁺-клеток нейрональной природы, проанализировали число клеток эндотелия, вступивших в митоз в результате действия обучающего (аверсивного неизбегаемого) стимула.

Мы обнаружили, что количество пролиферирующих BrdU⁺-эндотелиальных CD31⁺-клеток в СГЗ головного мозга у животных с интрагиппокампальным введением Aβ_25–35 изначально было увеличено в 4,4 раза относительно контроля (р = 0,0445) и на 28-й день было больше, чем у ЛО, на 95% (рис. 4), что соответствует динамике нейрогенных событий. У трансгенных животных линии 5xFAD ангиогенез в СГЗ усиливался транзиторно (количество эндотелиальных BrdU⁺-клеток увеличивалось почти в 3 раза на 7-й день после тренировки), но к 28-му дню, соответствующему проявлениям когнитивной дисфункции, мы наблюдали значительное, в 2 раза, снижение количества пролиферирующих эндотелиальных клеток (р = 0,0445; рис. 4).

 

Рис. 4. Изменение количества эндотелиальных BrdU⁺-клеток (CD31⁺) в СГЗ животных с интрагиппокампальным введением Aβ_25–35 и ЛО (А), интактных и трансгенных животных линии 5xFAD (В) на 7-й и 28-й дни после обучения.

 

Таким образом, у ЛО и животных с интрагиппокампальным введением β-амилоида в СГЗ после обучения происходит достоверное увеличение количества пролиферирующих клеток нейрональной и эндотелиальной природы, чьё вступление в митоз было инициировано в 1-й день обучения. У животных линии 5xFAD количество BrdU⁺-клеток нейрональной природы увеличивается к 28-м суткам, а число BrdU⁺-клеток эндотелия к этому периоду достоверно снижается, что свидетельствует о несоответствии «запроса» на опыт-индуцированный ангиогенез и нейрогенез при длительно развивающейся нейродегенерации альцгеймеровского типа.

Стимуляция ангиогенеза и ремоделирования микрососудистого дерева сопровождается изменением субпопуляционного состава клеток эндотелия с появлением фенотипически и метаболически отличающихся tip- и stalk-клеток, обеспечивающих, соответственно, миграцию и формирование стенки нового капилляра [25]. С целью изучения особенностей патологического ангиогенеза в двух моделях БА далее проанализировали наличие в СГЗ экспериментальных животных следующих типов эндотелиальных клеток: CXCR4/Dll4/VEGFR2 tip-клетки и Tie1/Notch/Ki-67 stalk-клетки, в соответствии с данными об экспрессионном профиле этих категорий клеток — участников неоангиогенеза [26].

У ЛО не происходило значимого изменения числа tip- и stalk-клеток эндотелия в СГЗ в динамике наблюдения после обучения, но в группе животных с интрагиппокампальным введением β-амилоида к 28-м суткам мы наблюдали достоверное увеличение количества tip-клеток (рис. 5). У интактных животных количество tip- и stalk-клеток эндотелия увеличивается к 28-м суткам, при этом профиль количества stalk-клеток может быть расценён как соответствующий изменению количества BrdU⁺CD31⁺-клеток (именно stalk-, но не tip-клетки, обладают способностью к пролиферации) [27]. У животных линии 5xFAD увеличения количества tip-клеток с 7-х до 28-х суток наблюдения не происходит, однако снижается число stalk-клеток и общее количество клеток эндотелия обоих вариантов активированного фенотипа достоверно ниже, чем в контроле (рис. 5).

Данные нормализованы на 100 DAPI⁺-клеток и представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения.

 

Рис. 5. Изменение количества CXCR4/DLL4/VEGFR2-иммунопозитивных (tip-) и TIE1/Ki-67/NOTCH-иммунопозитивных (stalk-) клеток эндотелия в СГЗ животных и животных с интрагиппокампальным введением Aβ_25–35 и ЛО (А, С), интактных и трансгенных животных линии 5xFAD (B, D) на 7-й и 28-й дни после обучения.

Данные нормализованы на 100 DAPI⁺-клеток и представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения.

 

Рис. 6. Сосудистая сеть в СГЗ гиппокампа на 28-й день после обучения.
A — сосудистая сеть СГЗ ЛО; B — сосудистая сеть СГЗ животного с интрагиппокампальным введением Aβ_25–35. Масштаб — 65 мкм.

 

Таким образом, животные с разными моделями БА демонстрируют разнонаправленные изменения количества tip- и stalk-клеток в СГЗ гиппокампа, что в целом свидетельствует о несовершенном неоангиогенезе. Это подтверждается обнаруженным нами снижением ветвления и плотности сосудистой сети в головном мозге животных с обеими моделями нейродегенерации альцгеймерского типа по сравнению с интактными животными на 7-й и 28-й дни после обучения (рис. 6, 7).

 

Рис. 7. Ветвление и плотность сосудистой сети в СГЗ гиппокампа ЛО и животных с интрагиппокампальным введением Aβ_25–35 (А, С), интактных животных и трансгенных животных линии 5xFAD (B, D) на 7-й и 28-й дни после обучения.

 

Обсуждение

Мы проанализировали особенности реализации пролиферативной активности клеток нейрональной и эндотелиальной природы в СГЗ, а также характера неоангиогенеза и ремоделирования микрососудистого дерева в этой нейрогенной нише головного мозга животных с двумя моделями БА: модель с интрагиппокампальным введением β-амилоида (воспроизводящая спорадические случаи БА) и трансгенная модель — линия мышей 5xFAD, характеризующаяся наличием комплекса мутаций, ассоциированных с развитием семейных форм БА у людей [28].

Мы обнаружили, что формирование когнитивной дисфункции на фоне применения теста УРПИ как модели обучения животных у мышей линии 5xFAD соответствует тому же периоду, что был ранее продемонстрирован нами для мышей с интрагиппокампальным введением Aβ_25–35 [29]: у животных обеих экспериментальных групп когнитивный дефицит регистрируется к 28-м суткам после 1-й сессии обучения в тесте УРПИ, что соответствует циклу индуцированного нейрогенеза в СГЗ гиппокампа — 4 нед [22].

Однако у животных обеих контрольных групп применение выбранного протокола обучения не привело к значительным изменениям числа пролиферирующих клеток нейрональной природы в СГЗ, тогда как при экспериментальном моделировании нейродегенерации альцгеймеровского типа регистрировалась интенсификация пролиферации клеток, достигающая максимума к 28-м суткам. С одной стороны, это соответствует нашим и другим экспериментальным данным о том, что при БА может быть зарегистрировано не только подавление нейрогенеза в нейрогенных нишах, но и его стимуляция, что обычно сопряжено с формированием провоспалительного микроокружения и аккумуляцией олигомеров β-амилоида, в том числе у трансгенных животных, демонстрирующих разнонаправленные изменения в зависимости от возраста [10, 11, 30–32], и у людей с БА [33].

С другой стороны, из этих данных следует, что интенсивность пролиферативных событий в СГЗ животных линии 5xFAD a priori снижена по сравнению с животными, перенёсшими интрагиппокампальное введение β-амилоида. Это позволяет считать, что пул нейральных стволовых и нейрональных прогениторных клеток у животных с моделью семейной формы БА в значительной степени повреждён, что не даёт возможности реализовать эффективный рекрутинг этих клеток при опыт-индуцированной стимуляции нейрогенеза. Мы полагаем, что это может быть связано с наличием длительного предшествующего периода формирования аберрантного нейрогенеза, начиная с эмбрионального этапа развития животных с генетическими моделями БА [34].

Одной из причин отсутствия значимой интенсификации нейрогенеза при обучении животных линии 5xFAD могут быть нарушения локального сосудистого скаффолда, обеспечивающего поддержание пула нейральных стволовых и нейрональных прогениторных клеток и их мобилизацию, пролиферацию и дифференцировку в нейрогенных нишах [15]. В условиях повышенной потребности в нейрогенезе (например, при обучении и консолидации памяти) подавление церебрального ангиогенеза приводит к ухудшению обучения и памяти [35]. Действительно, мы зарегистрировали снижение пролиферативной активности клеток эндотелия и подавление фенотипической конверсии клеток в tip- и stalk-фенотип у животных линии 5xFAD.

Животные контрольных групп продемонстрировали существенную интенсификацию неоангиогенеза (увеличение числа BrdU⁺CD31⁺-клеток) к 7-м и 28-м суткам после 1-й обучающей сессии. Аналогичная, и даже более выраженная динамика числа BrdU⁺CD31⁺-клеток эндотелия была обнаружена у животных после интрагиппокампального введения β-амилоида. Однако трансгенные животные линии 5хFAD характеризовались первоначальным увеличением числа клеток эндотелия, вступивших в митоз после обучения, с последующим значительным снижением их количества в СГЗ, что мы связываем с интенсификацией клеточной гибели (апоптоза) и/или усиленной регрессией микрососудов при наличии длительно развивающейся нейродегенерации у трансгенных животных, в отличие от животных, демонстрирующих в большей степени признаки острого токсического действия β-амилоида после его введения в ткань головного мозга.

Действительно, животные с генетической моделью БА имеют все ключевые признаки длительно развивающейся и прогрессирующей церебральной амилоидной ангиопатии с повреждением капиллярного русла головного мозга, что соответствует патогенезу БА у людей [36], в том числе в контексте формирования аберрантных микрососудов с нарушенной целостностью гематоэнцефалического барьера [37].

Примечательно, что если у животных с интрагиппокампальным введением Aβ_25–35 проангиогенная активность в СГЗ высока, но, вероятно, нарушен механизм латерального ингибирования (число tip-клеток выше, чем количество stalk-клеток, на протяжении всего периода наблюдения), то у трансгенных животных доминирует другой механизм нарушения ангиогенеза: пролиферативная активность клеток эндотелиальной природы быстро редуцируется (вероятно, вследствие апоптоза или стимуляции регрессии микрососудов), и это сопровождается отсутствием значимой конверсии клеток эндотелия в tip-фенотип.

Полученные новые данные в целом соответствуют ключевым изменениям, зарегистрированным нами ранее у животных с нейродегенерацией альцгеймеровского типа, индуцированной интрагиппокампальным введением β-амилоида: несбалансированная экспрессия LC3B, ZO1, VEGFR2, VEGFR3, CD146, ICAM2, Dll4, Tie2 в СВЗ [38], нарушение митохондриальной динамики и аутофагии клеток эндотелия в СГЗ и энторинальной коре [39], аберрантное созревание клеток эндотелия в СГЗ и СВЗ, проявляющееся изменением доли CLDN5⁺-клеток от общего числа CD31⁺-клеток [40], дизрегуляция числа tip-, stalk- и phalanx-клеток эндотелия в префронтальной коре головного мозга [41], повышение проницаемости микрососудов и нарушение их разветвлённости в CA1, CA2, CA3 зонах гиппокампа у животных линии 5xFAD [42]. Кроме того, у животных с интрагиппокампальным введением β-амилоида ранее обнаружили несбалансированный характер индуцированного нейрогенеза и ангиогенеза на пресимптоматической стадии развития патологии в СГЗ и СВЗ [10], разную динамику экспрессии Arg3.1/Arc в постмитотических юных нейронах СГЗ и СВЗ на фоне подавленной пролиферативной активности клеток в СГЗ и повышенной — в СВЗ [29].

Таким образом, в физиологических условиях обучение стимулирует пролиферативную активность клеток эндотелиальной природы в СГЗ гиппокампа, что, в отсутствие значимых изменений нейрогенеза, не ассоциировано с изменением фенотипа клеток эндотелия микрососудов СГЗ. У животных на фоне токсического действия олигомеров интрагиппокампально введённого Aβ_25–35 регистрируется индукция нейрогенных и ангиогенных событий в СГЗ, но нарушен механизм латерального ингибирования конверсии stalk-клеток в tip-клетки, в результате чего микроархитектура формирующейся сети капилляров гиппокампа нарушается. У животных с моделью генетически обусловленной БА «запрос» на усиленный неоангиогенез на фоне интенсифицированного нейрогенеза после обучения не реализуется в полной мере, что сопровождается отсутствием значимых субпопуляционных изменений клеток эндотелия и приводит к развитию аберрантной микрососудистой сети в гиппокампе.

Заключение

Феномен непродуктивного ангиогенеза и гиперваскуляризации, активно изучаемый в последние годы в контексте патогенеза БА [43, 44], имеет принципиально разные механизмы в СГЗ животных с двумя различными моделями нейродегенерации альцгеймеровского типа. Вне зависимости от доминирующего механизма нарушения пластичности, у животных с обеими моделями БА к 28-м суткам после когнитивной «нагрузки» (обучение в тесте УРПИ) регистрируется развитие когнитивного дефицита. Выявленные особенности реализации механизмов аберрантного нейрогенеза и ангиогенеза в гиппокампе должны учитываться при разработке новых терапевтических стратегий при спорадических и семейных формах БА.

 

Этическое утверждение. Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом Российского центра неврологии и нейронаук (протокол № 5-3/22 от 01.06.2022).

Источник финансирования. Исследование выполнено за счёт гранта Российского научного фонда № 22-15-00126, https://rscf.ru/project/22-15-00126/

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов: Аверчук А.С. — создание концепции исследования, анализ данных, проведение исследования, написание и редактирование рукописи; Кукла М.В., Розанова Н.А. — создание концепции исследования, анализ данных, проведение исследования; Ставровская А.В. — анализ данных, проведение исследования; Салмина А.Б. — создание концепции исследования, анализ данных, разработка методологии, руководство научно-исследовательской работой, получение финансирования, редактирование и утверждение окончательного варианта статьи.

Ethics approval. The study protocol was approved by the Local Ethics Committee of the Russian Center of Neurology and Neurosciences (Protocol No. 5-3/22, 1 June 2022).

Source of funding. The research was supported by the Russian Science Foundation (Grant No. 22-25-00126, https://rscf.ru/project/22-15-00126/).

Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.

Author contribution: Averchuk A.S. — conceptualization, data analysis, investigation, writing — original draft, writing — review and editing; Kukla M.V., Rozanova N.A. — conceptualization, data analysis, investigation; Stavrovskaya A.V. — data analysis, investigation, methodology; Salmina A.B. — conceptualization, methodology, supervision, data analysis, acquiring the funding, writing and editing.

Об авторах

Антон Сергеевич Аверчук

Российский центр неврологии и нейронаук

Автор, ответственный за переписку.
Email: antonaverchuk@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1284-6711

канд. биол. наук, доцент, с. н. с. лаб. нейробиологии и тканевой инженерии Института мозга

Россия, 105064, Москва, пер. Обуха, д. 5, стр. 2

Мария Владимировна Кукла

Российский центр неврологии и нейронаук

Email: antonaverchuk@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0700-4912

лаборант-исследователь лаб. нейробиологии и тканевой инженерии Института мозга

Россия, 105064, Москва, пер. Обуха, д. 5, стр. 2

Наталья Александровна Розанова

Российский центр неврологии и нейронаук

Email: antonaverchuk@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9619-4679

лаборант-исследователь, аспирант лаб. нейробиологии и тканевой инженерии Института мозга

Россия, 105064, Москва, пер. Обуха, д. 5, стр. 2

Алла Вадимовна Ставровская

Российский центр неврологии и нейронаук

Email: antonaverchuk@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8689-0934

канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории экспериментальной патологии нервной системы и нейрофармакологии Института мозга

Россия, 105064, Москва, пер. Обуха, д. 5, стр. 2

Алла Борисовна Салмина

Российский центр неврологии и нейронаук

Email: antonaverchuk@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4012-6348

доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник, зав. лаб. нейробиологии и тканевой инженерии Института мозга

Россия, 105064, Москва, пер. Обуха, д. 5, стр. 2

Список литературы

Дополнительные файлы