Clinical Exome Sequencing in Patients with Undifferentiated General Developmental Delay and Intellectual Disabilities

Full Text

Введение

Данные последних лет иллюстрируют огромный прогресс в области диагностики различных заболеваний, который был достигнут благодаря развитию массового параллельного секвенирования (massive parallel sequencing, MPS). MPS произвело революцию в клинической медицине, повысив шансы молекулярной диагностики редких генетических заболеваний. Примерно каждое пятое расстройство развития нервной системы диагностируется только с помощью данной технологии. Полезность MPS в клинической практике отмечена при диагностике общей задержки развития (ОЗР), интеллектуальных нарушений (ИН), расстройств аутистического спектра (РАС) и эпилепсии [1–4]. Расстройства развития нервной системы являются клинически разнообразными и генетически гетерогенными заболеваниями. Распространённость ОЗР/ИН колеблется от 1,0 до 3,0% в мировой популяции. Данные нарушения являются наиболее частой патологией развития нервной системы — например, в Англии доля ИН составляет 2,7% только среди детей школьного возраста [5–7].

Наиболее распространёнными причинами ОЗР/ИН являются генетические аномалии, пренатальные, перинатальные и постнатальные факторы [5]. Это могут быть инфекционные заболевания матери во время беременности (токсоплазмоз, краснуха, цитомегаловирус), приём токсических веществ (алкоголь, свинец, лекарственные препараты), перинатальная асфиксия, осложнения недоношенности (гипоксически-ишемические энцефалопатии и внутрижелудочковые кровоизлияния), радиоактивное излучение, энцефалиты и черепно-мозговые травмы. У некоторых пациентов связь между одним или несколькими из этих факторов и ОЗР/ИН очевидна, в то время как у других причинно-следственная связь трудно поддаётся оценке, поэтому в таких случаях следует учитывать вероятную генетическую этиологию.

Традиционно генетические варианты ОЗР/ИН подразделяются на хромосомные аномалии, вариации числа копий генов и генные мутации [8]. Большинство редких генетических нарушений вызваны мутациями, которые находятся в кодирующей части гена, но в некоторых случаях дефект может быть локализован в некодирующей области или в митохондриальной ДНК [9]. Этиологией ОЗР/ИН в 40% случаев являются моногенные заболевания, при этом у подавляющего большинства пациентов обнаруживаются мутации, возникающие de novo (при спорадических формах — до 60% в общей популяции). Средняя распространённость ОЗР, вызванных мутациями de novo, составляет 1 на 213–448 новорождённых, в зависимости от возраста родителей. Во всём мире ежегодно рождаются около 400 000 больных детей. Большинство моногенных заболеваний, связанных с ОЗР/ИН, имеют аутосомно-доминантный тип наследования; Х-сцепленные формы отмечаются у 5–10% пациентов, аутосомно-рецессивные — у 2–4% [1, 3, 10–13]. В российском исследовании доля пациентов с ОЗР и ИН генетической этиологии в среднем составила 34,1 ± 1,9%, из них пациенты с моногенной патологией — 16,9 ± 0,4% [14].

Большая гетерогенная группа заболеваний проявляется ОЗР/ИН и охватывает более 3000 различных нозологий, индивидуально редких, но в совокупности частых. Дифференциальный диагноз данных расстройств чрезвычайно труден. Известно о мутациях в более чем 1000 различных генах, которые могут вызывать данные нарушения [15]. Наиболее распространённые ОЗР/ИН ассоциированы с мутациями в генах PTCHD1, SHANK3, NLGN4, NRXN1, CNTNAP2, UBE3A, FMR1, MECP2, SETD5, ADNP, ARID1B, GRIN2B, SCN2A, CHD7, KAT6B, TCF4, ATRX, CUL4B, IL1RAPL1, PQBP1 [1, 11, 16, 17].

В литературе представлены многочисленные исследования, посвящённые изучению генетической этиологии ОЗР/ИН в различных популяциях [1, 11, 16, 17]. Распространённость каждого заболевания невелика, большая часть молекулярных основ патологии остаётся неизвестной, поэтому их диагностика является сложной задачей. Эти хронические расстройства с ранним началом вносят значительный вклад в заболеваемость, смертность и расходы системы здравоохранения, и их этиологическая диагностика необходима для медико-генетического консультирования, пренатального тестирования, медицинского наблюдения, лечения и профилактики осложнений данных нарушений.

Цель исследования — оценить эффективность поиска генетических причин у 33 пациентов с недифференцированной ОЗР/ИН с использованием клинического секвенирования экзома (КСЭ) и проанализировать сопутствующие клинические проявления у данных пациентов.

Материалы и методы

В исследование были включены 33 ребёнка (19 мальчиков и 14 девочек) с недифференцированной и несиндромальной ОЗР/ИН в возрасте 4,5 ± 2,4 года, наблюдавшихся в отделе коррекционной психологии и педагогики КГАНОУ «Хабаровский центр развития психологии и детства «Псилогия». Критерии включения пациентов в данное исследование: отсутствие специфического фенотипа для постановки синдромального диагноза, нормальный кариотип, отсутствие вариаций числа копий генов при исследовании хромосомного микроматричного анализа, референтные значения органических аминокислот в крови и моче при исследовании методом тандемной масс-спектрометрии, отсутствие патологических экспансий в гене FMR1. Проводился анализ клинико-генеалогического анамнеза, неврологического статуса и результатов молекулярно-генетических анализов. Диагноз ОЗР и ИН ставился на основании нейропсихологической диагностики — теста Д. Векслера для исследования интеллекта детей дошкольного возраста (4,0–6,5 года) в адаптации М.Н. Ильиной, «Диагностический комплект Семаго» — и заключения врача-психиатра; степень тяжести ИН варьировала от лёгкой до глубокой. Признаки РАС оценивали с помощью опросника «Checklist for Autism Spectrum Disorders», интервью для диагностики аутизма «Autism Diagnostic Interview» (переработанного), плана диагностического обследования при аутизме «Autism Diagnostic Observation Schedule» (2-я редакция).

Исследование было одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО ДВГМУ Минздрава России (протокол № 2 от 22.03.2022). От родителей всех пациентов было получено письменное информированное согласие.

Геномную ДНК выделяли из периферической крови методом лизиса клеток с последующей очисткой на стекловолоконных фильтрах, приготовлением геномных библиотек для MPS. Из полученных библиотек методом гибридизации были отобраны только те участки ДНК, которые соответствуют экзонам и сайтам сплайсинга с известным клиническим значением (4500 генов). Нуклеотидную последовательность определяли на секвенаторе «HiSeq 1500» («Illumina»), медианное покрытие 72×. Выявленные варианты классифицированы на основании стандартов и рекомендаций ACMG по интерпретации полиморфизмов [18]. Для оценки популяционных частот выявленных вариантов использованы выборки здоровых добровольцев проекта «Genome Aggregation Database». Для оценки клинической релевантности выявленных вариантов использованы базы данных OMIM, ClinVar, специализированные базы данных по отдельным заболеваниям (при наличии). Для подтверждения вариантов, выявленных в результате КСЭ, и оценки сегрегации в семье использован метод секвенирования по Сэнгеру.

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью пакета программы «SPSS». Качественные данные были представлены в виде частот и процентов. При нормальном распределении признака рассчитывали среднее арифметическое (М) и стандартное отклонение (SD). Для сравнения двух независимых групп использовали t-критерий Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05.

Результаты

В общей выборке пациентов с ОЗР/ИН (n = 33) задержка речевого и психического развития отмечалась у 100%, РАС — у 45,5%, инсомнические расстройства (трудности при засыпании, ночные пробуждения) — у 39,4%, эпилепсия — у 39,4%, регресс развития — у 36,4%, задержка моторного развития — у 30,3%.

При проведении КСЭ у 25 (76%) пациентов зарегистрированы различные генетические варианты, из них 17 — с «неопределённой клинической значимостью» и 8 — «вероятно патогенные». После анализа сегрегации в семье и проведения секвенирования по Сэнгеру обнаруженных вариантов у пробандов и их родителей было подтверждено 13 патогенных вариантов, из них 5 были переквалифицированы из «вариантов с неизвестной клинической значимостью» в «патогенные», т.е. эффективность КСЭ в данной выборке детей с ОЗР/ИН составила 39,4%. Обнаруженные патогенные варианты в генах и клинические характеристики 13 пациентов представлены в таблице, в 10 случаях обнаружены мутации de novo. По типу наследования 3 заболевания имели аутосомно-рецессивное (2 компаунд-гетерозиготы, 1 гомозигота), 4 — Х-сцепленное (3 — доминантное, 1 — рецессивное, все варианты de novo), 6 — аутосомно-доминантное наследование (все варианты de novo).

 

Патогенные варианты и соответствующий диагноз, клинические проявления / Pathogenic variants and corresponding diagnosis, clinical manifestations

№ No.	Пол Gender	Ген Gene	Тип мутации Type of mutation	Мутация Mutation	Классификация ACMG [18] Classification ACMG [18]	Диагноз Diagnosis	Задержка моторного развития Motor developmental delay	Задержка речевого развития Speech developmental delay	Задержка психического развития Mental developmental delay	Инсомнические расстройства Insomnia disorders	Расстройство аутистического спектра Autism spectrum disorder	Регресс развития навыков Skill development regression	Эпилепсия Epilepsy
1	Ж | F	MECP2	Гетерозиготный Heterozygous	c.3G > C (p.Met1?)	Вероятно патогенный Probably pathogenic	Синдром Ретта Rett syndrome (OMIM #312750)	+	+	+	+	+	+	+
2	Ж | F	WDR45	Гетерозиготный Heterozygous	c.341+2T > A	Патогенный Pathogenic	Нейродегенерация с накоплением железа в мозге 5-го типа Neurodegeneration with brain iron accumulation 5 (OMIM #300894)	+	+	+	+	–	–	–
3	М | M	SYNJ1	Гетерозиготный Heterozygous	с3509-11T > G	С неизвестным клиническим значением With unknown clinical significance	Ранняя младенческая эпилептическая энцефалопатия 53-го типа Developmental and epileptic encephalopathy 53 (OMIM #617389)	+	+	+	–	–	–	+
6	М | M	MECP2	Гетерозиготный Heterozygous	c.455C > T (p.Ala152Val) [19, 20]	Патогенный Pathogenic	Х-сцепленная умственная отсталость, тип Луба Intellectual developmental disorder, X-linked, syndromic, Lubs type (OMIM #300260)	–	+	+	+	+	–	+
10	Ж | F	ADAR	Компаунд- гетерозиготный Compound heterozygous	c.577C > G (p.Pro19 3Ala) [21]	Вероятно патогенный Probably pathogenic	Синдром Айкарди–Гутьерес 6 типа Aicardi–Goutieres syndrome 6 (OMIM #615010)	+	+	+	–	–	–	–
				c.2304G > A (p.Trp768*)	Патогенный Pathogenic
12	М | M	PMM2	Компаунд- гетерозиготный Compound heterozygous	c.357C > A (p.F119L) [22]	Патогенный Pathogenic	Нарушение гликозилирования 1А типа Congenital disorder of glycosylation, type Ia (OMIM #212065)	+	+	+	–	–	–	–
				c.422G > A (p.R141H) [23]	Патогенный Pathogenic
14	Ж | F	SHANK3	Гетерозиготный Heterozygous	c.2486delC (p.Pro829fs)	Патогенный Pathogenic	Синдром Фелан–МакДермид Phelan-McDermid syndrome (OMIM #606232)	–	+	+	+	+	–	+
16	Ж | F	KMT5B	Гетерозиготный Heterozygous	c.458C > G (p.Ala153Gly)	С неизвестным клиническим значением With unknown clinical significance	Аутосомно- доминантная умственная отсталость 51-го типа Аutosomal dominant intellectual developmental disorder-51 (OMIM #617788)	–	+	+	+	+	+	–
20	Ж | F	UBE3A	Гетерозиготный Heterozygous	c.2419A > G (Thr807Ala) [24, 25]	Вероятно патогенный Probably pathogenic	Синдром Ангельмана Angelman syndrome (OMIM #105830)	–	+	+	+	–	+	–
21	Ж | F	PTPN11	Гетерозиготный Heterozygous	c.417G > C (p.Glu139Asp)	Патогенный Pathogenic	Синдром Нунан 1 типа Noonan syndrome 1 (OMIM #163950)	–	+	+	–	–	+	–
25	Ж | F	CTNNB1	Гетерозиготный Heterozygous	c.1919dupT (p.Thr641fs)	Патогенный Pathogenic	Нарушение нейропсихического развития со спастической диплегией и зрительными нарушениями Neurodevelopmental disorder with spastic diplegia and visual defects (OMIM #615075)	+	+	+	–	–	–	–
33	Ж | F	MTOR	Гетерозиготный Heterozygous	c.1796delT (p.Leu599fs)	Патогенный Pathogenic	Синдром Смит–Кингсмора Smith–Kingsmore syndrome (OMIM #616638)	–	+	+	–	+	+	–
23	Ж | F	MECP2	Гетерозиготный Heterozygous	c.433C > T (p.Arg145Cys) [26]	Патогенный Pathogenic	Синдром Ретта Rett syndrome (OMIM #312750)	–	+	+	+	+	–	+

 

По половому распределению в группе с обнаруженным генетическим заболеванием было доминирование женского пола (10 пациентов в сравнении с 4 пациентами группы, где мутаций не обнаружено).

Патогенные варианты чаще выявлялись у пациентов с задержкой моторного развития (53,8% против 15,0%; p < 0,05). У пациентов с генетическими заболеваниями наиболее часто диагностировались инсомнические расстройства по типу трудности при засыпании, ночные пробуждения, отказ от дневного сна (46,2%), РАС (38,5%), регресс развития (38,5%) и эпилепсия (38,5%).

Краткое описание пациентов с подтверждённым молекулярным диагнозом и эпилепсией приведено ниже.

1. У пациенток № 1 и № 23 с синдромом Ретта (OMIM #312750) отмечался регресс развития в двухлетнем возрасте, видеоэлектроэнцефалографический (ВЭЭГ) мониторинг бодрствования и физиологического ночного сна впервые был проведён в возрасте 3 лет. При анализе ВЭЭГ-мониторинга пациентки № 1 регистрировались: основной ритм по возрасту, в бодрствовании наблюдалась эпилептиформная активность (ЭА), состоящая из одиночных и сгруппированных доброкачественных эпилептиформных разрядов детства (ДЭРД) в правой теменной и левой центральной областях; в состоянии сна ЭА приобретала ритмичный, продолженный характер, билатерально, в правой теменной, в левой височной и в левом центральной областях, индекс представленности ЭА до 75%. У пациентки № 23 по ВЭЭГ-мониторингу регистрировались: основной ритм по возрасту, сон модулирован, физиологические паттерны атипичны, редуцированы. В состоянии сна регистрируются региональная ЭА в виде полипиков; сгруппированные комплексы пик–волна; острая медленная волна, по морфологии напоминающая ДЭРД, приобретающая продолженный характер с индексом представленности ЭА до 80%. Эпилептические приступы у данных пациенток не зафиксированы.
2. В анамнезе пациента № 6 с Х-сцепленной умственной отсталостью, тип Лимба (OMIM #300260) отмечалась задержка развития после 2-летнего возраста. ВЭЭГ-мониторинг провели впервые в возрасте 4 года: основной ритм замедлён, паттерны сна не сформированы, регистрируется продолженная ЭА в виде ДЭРД на протяжении всего сна по левой гемисфере с вторичной билатеральной синхронизацией с фокусом в левых лобных отведениях, индекс представленности ЭА достигал 80%. Эпилептические приступы у пациента не зафиксированы.
3. Пациент № 3 с ранней младенческой эпилептической энцефалопатией 53-го типа (OMIM #617389), дебют заболевания на 15-й день жизни с началом развития генерализованных тонико-клонических приступов с запрокидыванием головы, заведением глаз вверх продолжительностью до 50 с, 2–3 приступа в день ежедневно. В 1 мес проведён ВЭЭГ длительностью 1 ч в состояниях бодрствования и физиологического дневного сна. Установлено замедление основного ритма, во сне регистрируется региональная продолженная ЭА в виде комплексов острой медленной волны в левом центральном отделе. В 4 мес на фоне фармакорезистентных приступов проведён повторный ВЭЭГ-мониторинг длительностью 2 ч в состоянии бодрствования и физиологического дневного сна. Зафиксировано замедление основного ритма, при бодрствовании регистрируется ЭА по типу острой медленной волны в теменно-центрально-височных отделах левого полушария и лобно-теменном отделе правого полушария, во сне преобладает паттерн гипсаритмии, паттерн «вспышка–подавление»; стадии сна и фазы сна не дифференцируются, физиологические феномены сна не просматриваются; в состоянии бодрствования и при пробуждении зарегистрированы тонические экстензорные спазмы, окулотонические приступы, сопровождающиеся иктальным паттерном в виде генерализованной быстрой активности.
4. Пациент № 14 с синдромом Фелан–МакДермид (OMIM #606232) и задержкой развития после 2-летнего возраста, с 1 года 9 мес до 5 лет наблюдались фебрильные приступы по типу абсансов. По ВЭЭГ-мониторингу ЭА не зафиксировано.

Обсуждение

Результаты проведённого нами исследования выявили генетическую этиологию у 39,4% пациентов с ОЗР/ИН (мутации в генах MECP2, WDR45, SYNJ1, ADAR, PMM2, SHANK3, KMT5B, UBE3A, PTPN11, CTNNB1, MTOR). Данный результат эффективности проведения КСЭ при ОЗР/ИН превышает диагностическую эффективность панельного и полноэкзомного секвенирования в сравнении с метаанализом эффективности применения MPS у пациентов с эпилепсией, РАС и ОЗР/ИН, куда были включены 103 исследования c общей выборкой 32 331 пациента: диагностический результат составил 17,1% у пациентов с РАС, 24,0% — при эпилепсии, 28,2% — при ОЗР/ИН [27]. В другом исследовании 150 пациентов с ОЗР/ИН и РАС общий диагностический результат панельного секвенирования составил 27,0%; была выявлена генетическая причина заболевания у 17% пациентов, связанная с мутациями в генах ASH1L, MED13L, TRIO, SYNGAP1, SHANK3, SETBP1, SATB2, RAB39B, OPHN1, MECP2, GRIN2B, GRIA3, EHMT1, DYRK1A, CASK, ATRX, ARID1B, ANKRD11. Наиболее часто обнаруживались мутации в генах ANKRD11, CASK, EHMT1, GRIN2B, MECP2, SHANK3, TRIO [28].

Результаты нашей работы сопоставимы по эффективности с проведением полноэкзомного секвенирования у детей с ОЗР/ИН в недавнем систематическом метаанализе 30 ге- нетических исследований пациентов с различными нарушениями развития (16% случаев при РАС и 39% — при ОЗР/ИН) [29]. В 2019 г. были опубликованы результаты российского исследования, в котором эффективность полноэкзомного секвенирования у 69 пациентов с ИН составила 20 %, а КСЭ у 31 пациента с ИН — 29% (обнаружены мутации в генах KMT2D, VPS13B, PTEN, SMARCA2, SON, RAI1, ADNP, PIGN, SGSH, STXBP1, KCNQ2, DYRK1A, GRIN1, PPP2R5D, PPP2R1A, TRIP12, GRIA1, NEXMIF, DDX3X, AFF3 [30]. В 2022 г. представлены данные анализа 198 пациентов с ИН из 171 семьи в российской популяции, где эффективность полноэкзомного секвенирования составила 26,9% (ИН были чаще ассоциированы с мутациями в генах SMARCA2, SMARCA4, ADNP, ACTL6B) [31].

В нашей работе самый распространённый патогенный вариант у детей с ОЗР/ИН был связан с геном MECP2 (3 (23,1%) пациента из 13), что согласуется с международными данными [1, 11, 16, 17]. У 60,6% пациентов не обнаружены клинически значимые варианты, что свидетельствует о необходимости продолжения диагностического поиска с использованием секвенирования полного генома, т.к. КСЭ имеет ограничения (анализируются только кодирующие участки генов с известным клиническим значением, не анализируются некодирующие, регуляторные области генов и митохондриальный геном).

При анализе сопутствующих клинических проявлений выявлены достоверный факт задержки моторного развития у детей с генетической патологией и преобладание пациентов женского пола. Данные факторы можно рассматривать как относительное показание к проведению КСЭ у девочек с ОЗР/ИН, сочетающихся с задержкой моторного развития, что будет увеличивать результативность молекулярно-генетических анализов.

Заключение

Результаты исследования позволяют предположить, что пациенты, наблюдающиеся в настоящее время с диагнозом ОЗР/ИН, должны быть дообследованы с проведением молекулярно-генетических методов. Неврологи и психиатры при осмотре детей с ОЗР/ИН должны быть насторожены в отношении наследственных заболеваний и при отрицательных результатах рутинных методов обследования, которые не дают точной этиологии, привлекать молекулярно-генетическую диагностику для предупреждения неэффективных терапевтических подходов. Стоит отметить, что для пациентов, получивших положительный молекулярный результат, этот шаг не только завершил «диагностическую одиссею», но и предоставил ценную и точную информацию для оказания медицинской помощи пациентам и их семьям.

About the authors

Dmitriy V. I

Khabarovsk Center for the Development of Psychology and Childhood «Psylogia»; Far-East State Medical University

Author for correspondence.
Email: i.dmitry@psylogia.ru
ORCID iD: 0000-0002-9967-0279
SPIN-code: 3332-5052
Scopus Author ID: 57226670660
ResearcherId: AAE-2838-2022

Cand. Sci. (Med.), Deputy Director General for research and medical activities, Associate Professor, Department of neurology and neurosurgery

Россия, Khabarovsk; Khabarovsk

Viktoriya A. Ioksha

Far-East State Medical University

Email: vioksha980@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7548-3831

student, Pediatric faculty

Россия, Khabarovsk

Tatyana N. Proskokova

Far-East State Medical University

Email: proskokova2011@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5209-2440

D. Sci. (Med.), Prof., Department of neurology and neurosurgery

Россия, Khabarovsk

References

Supplementary files