Predicting the efficacy of anti-B-cell therapy in patients with multiple sclerosis

Full Text

Введение

Существует представление о рассеянном склерозе (РС) как о гетерогенном, многофакторном иммунно-опосредованном заболевании, в патогенезе которого ключевую роль играют не только Т-клетки, но и В-лимфоциты. В-клетки иммунной системы, которые представляют антигены Т-лимфоцитам и вырабатывают цитокины, играющие роль медиаторов воспаления [1, 2], продуцируют аутоиммунные антитела к компонентам миелина, что влияет на процессы демиелинизации и повреждение аксонов, иными словами, они обеспечивают гуморальный иммунный ответ на всех стадиях РС [3].

Методы лечения РС, основанные на понимании его патогенеза, включают в себя снижение активности Th1/Th17-клеток, активацию T-регуляторных клеток, подавление миграции лимфоцитов в нервную систему и воздействие на B-клетки. Пока нет полного понимания механизмов аутоиммунного воспаления, включая роль B-регуляторных клеток и их функции [4, 5].

Внимание исследователей направлено на разработку подходов к лечению РС на основе анти-В-клеточной терапии, в частности, с использованием моноклональных антител (МАТ) к CD20. Этот белок экспрессируется на пре-В-клетках, зрелых В-клетках и клетках памяти, но не на ранних В-клеточных предшественниках или плазматических клетках. МАТ к CD20 уменьшают количество В-клеток через антителозависимые механизмы, такие как фагоцитоз, клеточная цитотоксичность и апоптоз, что приводит к снижению иммунопатологического воспаления при РС. При этом сохраняются способность к восстановлению В-клеток, гуморальный и врождённый иммунитет, а общее количество Т-клеток практически не изменяется [6–9].

Экспериментальные и клинические исследования направлены на изучение механизмов истощения и восстановления анти-CD20-терапией богатых В-клетками иммунологических компартментов, таких как костный мозг, периферическая кровь (ПК), селезёнка и лимфатические узлы, а также функционального состояния В-клеток после их временной элиминации [10, 11]. Самая высокая эффективность истощения В-клеток была достигнута в крови, где они практически отсутствовали после лечения анти-CD20-МАТ, самое слабое снижение CD19+-В-клеток наблюдалось в костном мозге. После прекращения лечения CD20+-В-клетки одновременно заселялись в костный мозг и селезёнку, прежде чем вновь появлялись в крови [10].

Одним из важнейших вопросов, связанных с назначением анти-В-клеточной терапии, является необходимость определения критериев персонализированного подхода при назначении таких препаратов, а именно выявление прогностических маркеров оптимального ответа на терапию, дозировки и частоты введения лекарственного средства, так как из-за резкого снижения популяции CD19+-В-клеток введение препарата каждые 6 мес может оказаться слишком частым для некоторых пациентов. С этой точки зрения таким прогностическим маркером считали содержание B-клеток иммунологической памяти (CD19+CD27+) [12–14].

Для реальной клинической практики нам представляется особенно актуальным исследование влияния анти-CD20-МАТ на более широкий спектр параметров клеточного врождённого и адаптивного иммунитета у пациентов с РС именно в ПК с целью оценки системного действия препарата.

Цель работы — исследование особенностей субпопуляционного состава и функциональной активности лимфоцитов и моноцитов ПК у пациентов с агрессивным РС в первые 6 мес проведения анти-В-клеточной терапии.

Материалы и методы

Критерии включения в исследование:

• подписанное пациентом информированное согласие;
• агрессивное течение РС;
• терапия анти-CD20-МАТ не менее 24 мес;
• наличие результатов исследования клеточного иммунитета до начала терапии и через 6 мес после первого введения препарата.

Критерии невключения:

• отсутствие информированного согласия;
• наличие противопоказаний к назначению терапии анти-CD20-МАТ;
• отсутствие возможностей динамического наблюдения за пациентом.

Контрольную группу составили 10 практически здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту.

Исследование проводили в соответствии с положениями Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации, Международного совета по гармонизации и местного законодательства. Все участники исследования предоставили письменное согласие после подробного обсуждения протокола. Исследование одобрено независимым этическим комитетом при МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского (протокол № 8 от 13.06.2019).

Пациентов с РС (n = 29) обследовали в соответствии с клиническими рекомендациями¹ для выявления противопоказаний к назначению анти-В-клеточной терапии рекомбинантным гуманизированным МАТ, селективно воздействующим на В-клетки, экспрессирующие CD20 (анти-CD20-МАТ). Первое введение анти-CD20-МАТ осуществляли в виде двукратной инфузии внутривенно через специальную систему по 300 мг препарата с перерывом 2 нед, последующие однократные инфузии препарата в дозе 600 мг — 1 раз в 6 мес. Показатели клеточного иммунитета в периферической крови (ПК) исследовали перед 1-м курсом анти-CD20-МАТ и на фоне последующих курсов в сроки 6, 12, 18 и 24 мес после 1-го курса лечения с оценкой динамики функционального состояния и нейровизуализации.

Параметры клеточного иммунитета у пациентов с РС оценивали методом 6-цветной проточной цитометрии с использованием панели МАТ («Becton Dickinson») к дифференцировочным антигенам лимфоцитов и моноцитов ПК.

Проанализировали содержание и абсолютное количество Т-лимфоцитов (CD3+), В-лимфоцитов (CD19+СD20+), естественных клеток-киллеров (NK) — CD3–CD16+CD56+, Т-хелперной (CD3+CD4+), Т-цитотоксической (CD3+CD8+) и NKT-субпопуляций (CD3+CD16+CD56+), содержание активированных Т-лимфоцитов (CD3+CD25+, CD3+HLA-DR+, CD3+CD95+) в пределах популяции CD45+-лимфоцитов. Экспрессию HLA-DR на моноцитах ПК оценивали по количеству CD14+HLA-DR+-клеток, интенсивность экспрессии HLA-DR на моноцитах ПК — по параметру средней интенсивности флюоресценции (Mean Fluoroescence Intensity, MFI), который отражает плотность распределения молекулы HLA-DR на мембране моноцитов и свидетельствует об их антигенпрезентирующей функции.

Одной из задач исследования являлось изучение иммунофенотипических особенностей и сроков восстановления В-лимфоцитов ПК после лечения препаратом анти-CD20-МАТ. Предполагалось, что не у всех пациентов РС через 6 мес после применения 1-го курса анти-CD20-МАТ можно детектировать В-лимфоциты при цитометрическом анализе всей лимфоцитарной популяции — в гейте CD45+ против канала бокового светорассеивания, когда в анализ включается максимум 50 000 событий. Действительно, у большинства пациентов (в 85% случаев) CD19+-клетки отсутствовали. В связи с этим мы применили метод концентрации клеточных элементов, позволяющий набрать большое количество В-лимфоцитов, образующих полноценный кластер. Для этого образцы ПК предварительно разливали на несколько порций по 500–1000 мкл, лизировали эритроциты раствором PharmLyse («Becton Dickinson»), после двукратной отмывки раствором фосфатно-солевого буфера концентрировали осадок в одной пробирке. Далее образцы ПК после инкубации с МАТ к антигенам дифференцировки лимфоцитов определённой специфичности (CD), конъюгированными с флюоресцентными красителями, подвергали цитометрическому анализу. Детекцию В-лимфоцитов проводили по экспрессии CD19+ против канала бокового светорассеивания, в анализ включали не менее 500 000 событий.

Таким образом, в пределах гейта CD19+-лимфоцитов определяли субпопуляционный состав В-лимфоцитов: B1-клетки (CD5+), В-клетки памяти (CD27+), экспрессию костимулирующих и активационных антигенов (CD40, CD25, CD38, CD95).

Статистический анализ выполняли с помощью программного обеспечения SPSS Statistics v. 23 («IBM Corp.»). Для оценки нормального распределения переменных использовали критерий Колмогорова–Смирнова, для определения различий между группами — t-критерий Стьюдента для непарных выборок с дополнительным определением критерия Манна–Уитни, t-критерий Стьюдента для одной выборки с проведением однофакторного дисперсного анализа, t-критерий Стьюдента для связанных выборок с определением критерия Вилкоксона (при p < 0,05 различия достоверны). Для определения силы зависимости одной переменной от другой проводили регрессионный анализ с включением доверительного интервала Дарбина–Уотсона, частичных и частных корреляций (при p < 0,05 влияние значимое). Для определения различий между номинальными переменными в несвязанных выборках с выделением наиболее значимого фактора отличия использовали дискриминантный анализ с определением лямбды Уилкса с включением однофакторного дисперсионного анализа, F-критерия равенства дисперсий Фишера и пошаговой регрессией. Количественные данные по оценке экспрессии HLA-DR на моноцитах ПК представлены в виде медианы и квартилей (Me [Q₁; Q₃]), для сравнения использовали тест Краскела–Уоллиса. Различия между выборками, в которых зарегистрирован исследуемый признак с вероятностью ошибки первого рода менее 5% (p < 0,05), определяли как значимые, в случае множественных попарных сравнений применяли поправку Бонферрони.

Результаты

Коррекцию терапии РС с назначением анти-CD20-МАТ проводили 29 пациентам обследованной группы: 22 (75,9%) женщинам и 7 (24,1%) мужчинам; средний возраст 36,9 ± 7,7 года, длительность РС 15,7 (95% ДИ 6,42– 24,91) года, среднее значение EDSS 3,2 ± 1,5 балла. С момента постановки диагноза РС пациенты использовали в среднем 3,7 (95% ДИ 2,83–4,59) варианта терапии препаратами, изменяющими течение РС (ПИТРС).

На момент включения в исследование из 29 пациентов с агрессивным РС 6 (23,6%) получали интерферон-β; 19 (65,2%) — натализумаб, 1 (3,4%) — терифлуномид, 1 (3,4%) — глатирамера ацетат, у 2 (6,9%) наивных пациентов терапия РС началась с анти-CD20-МАТ.

Из 19 пациентов, у которых последним препаратом до коррекции лечения был натализумаб, у 14 смена терапии обусловлена высоким индексом титра антител к вирусу Джона Каннингема, длительностью лечения более 24 мес и высоким риском развития прогрессирующей мультифокальной лейкоэнцефалопатии; у 4 — зарегистрировано утяжеление течения РС — переход во вторично-прогрессирующий РС. «Отмывочный интервал» при переводе с натализумаба на анти-CD20-МАТ составил 7,4 (95% ДИ 4,14–10,71) мес. У 20 (71,3%) пациентов на момент включения в исследуемую группу отмечалось обострение РС за предшествующие 12 мес, в том числе у пациентов в отмывочный период после прекращения лечения натализумабом.

Общее количество лимфоцитов ПК пациентов до введения анти-CD20-МАТ было существенно выше (р = 0,001) по сравнению с группой здоровых добровольцев (табл. 1), что, вероятно, объясняется предшествующим приёмом натализумаба, который может сопровождаться повышением количества лимфоцитов в ПК [15].

В обследованной нами группе пациентов отмечено значительное увеличение относительного, но не абсолютного количества Т-хелперных лимфоцитов, снижение относительного числа Т-цитотоксической и NKT-субпопуляций, а также снижение абсолютного числа NK-лимфоцитов ПК по сравнению с нормальными значениями. Уровень Т- и В-лимфоцитов по маркерам CD19, CD20, а также их антигенпрезентирующий потенциал (субпопуляция CD19+HLA-DR+) не отличались от нормальных показателей. С другой стороны, у пациентов до коррекции терапии анти-CD20-МАТ наблюдалось значимое снижение уровня активированных Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR+).

 

Таблица 1. Показатели клеточного иммунитета у больных РС (M ± SD)

Показатель		До начала В-клеточной терапии (n = 29)	Через 6 мес после 1-го введения анти-CD20-МАТ (n = 29)	Здоровые добровольцы (n = 10)	p
		1	2	3
Общее количество лимфоцитов	X 109/л	2145,6 ± 784,3	1725,4 ± 648,9	2070,0 ± 101,3	р 1-2 < 0,001* р 1-3 = 0,001* р 2-3 = 0,001*
Т-лимфоциты CD3+	% клеток абс.	75,67 ± 6,71 1520,7 ± 118,2	85,03 ± 5,63 1352,9 ± 65,9	74,97 ± 1,53 1670,7 ± 131,5	р 1-2 = 0,001* р 1-3 = 0,09 р 2-3 = 0,001 * р 1-2 = 0,107 р 1-3 = 0,1230 р 2-3 = 0,0173
Т-хелперные лимфоциты CD3+CD4+	% клеток абс.	46,84 ± 7,75 939,2 ± 71,9	51,54 ± 10,64 795,8 ± 64,4	40,69 ± 2,27 1125,5 ± 103,2	р 1-2 = 0,001* р 1-3 < 0,001* р 2-3 = 0,001* р 1-2 = 0,0678 р 1-3 = 0,6870 р 2-3 = 0,0044*
T-цитотоксические лимфоциты CD3+CD8+	% клеток абс.	26,89 ± 7,96 565,7 ± 75,6	31,43 ± 10,51 477,6 ± 49,7	33,00 ± 3,08 537,9 ± 56,4	р 1-2 = 0,05 р 1-3 < 0,001* р 2-3 = 0,484 р 1-2 = 0,1633 р 1-3 = 0,3820 р 2-3 = 0,2076
NK-лимфоциты CD3-CD16+CD56+	% клеток абс.	11,50 ± 4,46 189,0 ± 25,2	12,76 ± 6,09 180,3 ± 17,2	12,47 ± 1,70 328,7 ± 18,4	р 1-2 = 0,001* р 1-3 = 0,281 р 2-3 = 0,821 р 1-2 = 0,3857 р 1-3 < 0,0000* р 2-3 < 0,0000*
NKT-лимфоциты CD3+CD16+CD56+	% клеток	6,01 ± 4,52	5,7 ± 3,68	10,50 ± 1,73	р 1-2 = 0,001* р 1-3 = 0,001* р 2-3 = 0,001 *
В-лимфоциты CD19+	% клеток абс.	12,78 ± 4,8 284,7 ± 60,3	1,6 ± 2,25 25,7 ± 10,0	11,79 ± 1,86 271,6 ± 29,6	р 1-2 = 0,001* р 1-3 = 0,290 р 2-3 < 0,001* р  1-2 < 0,001* р  1-3 = 0,4214 р  2-3 < 0,001*
В-лимфоциты CD20+	% клеток	12,25 ± 3,44	0,75 ± 1,37	11,19 ± 1,83	р  1-2 < 0,001* р  1-3 = 0,723 р  2-3 < 0,001*
CD3+HLA-DR+	% клеток	7,67 ± 3,08	6,11 ± 2,52	13,30 ± 2,60	р  1-2 = 0,001* р  1-3 = 0,001* р  2-3 < 0,001*
CD19+HLA-DR+	% клеток	9,86 ± 5,3	1,30 ± 1,94	10,32 ± 3,41	р  1-2 = 0,001* р  1-3 = 0,709 р  2-3 < 0,001*
CD3+CD25+	% клеток	19,6 ± 6,64	26,81 ± 23,83	11,16 ± 5,22	р  1-2 = 0,06 р  1-3 = 0,056 р  2-3 = 0,35
CD3+CD95+	% клеток	10,5 ± 6,85	44,42 ± 25,05	42,14 ± 18,99	р  1-2 < 0,001* р  1-3 = 0,69

Примечание. Результаты представлены в виде относительного (% клеток от общего числа лимфоцитов CD45+) и абсолютного (количество клеток в 1 мкл ПК) числа лимфоцитов. *Различие значимо с учётом поправки Бонферрони.

 

Через 6 мес после 1-го курса анти-CD20-МАТ у пациентов выявлено значительное снижение общего количества лимфоцитов ПК по сравнению с исходными значениями и группой контроля (табл. 1), но это снижение не достигало значений, определяемых по Общей шкале токсичности². По относительным параметрам у пациентов наблюдалось значительное повышение уровня Т-популяции и Т-хелперной субпопуляции лимфоцитов ПК, но оно связано с компенсаторными механизмами в связи с деплецией В-лимфоцитов, содержание которых не было восстановлено до нормальных значений к моменту исследования. Абсолютные значения данных показателей были значительно снижены даже по сравнению с группой контроля. Уровень Т-цитотоксической субпопуляции как в относительном, так и в абсолютном выражении существенно не отличался от такового у здоровых добровольцев. Отмечено также выраженное снижение абсолютного количества NK-клеток, содержания NKT-субпопуляции и низкий уровень активированных Т-лимфоцитов. Считается, что NK-клетки играют двойную роль при РС: с одной стороны, они могут оказывать цитотоксическое действие на аутореактивные эффекторные клетки, а с другой — способствуют повреждению и лизису астроцитов и олигодендроцитов, а также могут влиять на уровень Т-регуляторных клеток у больных РС [16].

Относительное содержание В-лимфоцитов пациентов колебалось в диапазоне от 0 до 7,5%, только у 15% пациентов достигло нормальных значений и составило 6,0–7,5%; у 38% больных содержание В-лимфоцитов детектировано в диапазоне 2–4%; у 47% пациентов — до 1%. Таким образом, у 85% не произошло нормализации содержания В-лимфоцитов. Соответственно, содержание В-лимфоцитов, способных к ангигенпрезентации (CD19+HLA-DR+), было резко сниженным.

До терапии анти-CD20-МАТ у пациентов с РС доля В-лимфоцитов, экспрессирующих костимулирующую молекулу CD40, маркера готовности к апоптозу CD95, а также субпопуляции В1-лимфоцитов (CD19+CD5+), ассоциированной с продукцией аутоантител, значимо не отличались от показателей контрольной группы (табл. 2).

 

Таблица 2. Показатели В-клеточного иммунитета у пациентов с РС, % клеток в пределах гейта В-лимфоцитов CD19+

Популяция лимфоцитов	До начала В-клеточной терапии (n = 29)	Через 6 мес после 1-го введения анти-CD20-МАТ (n = 29)	Здоровые добровольцы (n = 10)	p
	1	2	3
CD40+	48,32 ± 27,49	17,13 ± 23,12	49,20 ± 4,45	p 1-2 = 0,001* p 1-3 = 0,883 p 2-3 = 0,001*
CD95+	23,02 ± 17,32	25,85 ± 25,05	19,89 ± 2,3	p 1-2 = 0,004* p 1-3 = 0,406 p 2-3 = 0,427
CD5+	14,35 ± 11,10	21,38 ± 20,21	17,29 ± 3,96	p 1-2 = 0,004* p 1-3 = 0,228 p 2-3 = 0,497
CD27+	37,40 ± 15,321	25,45 ± 18,15	28,30 ± 2,74	p 1-2 = 0,001* p 1-3 = 0,01* p 2-3 = 0,599
CD38+	34,41 ± 20,81	29,04 ± 23,241	16,10 ± 2,63	p 1-2 = 0,001* p 1-3 = 0,001* p 2-3 = 0,08
CD25+	23,16 ± 14,59	13,93 ± 12,83	13,93 ± 12,82	p 1-2 = 0,003* p 1-3 = 0,007*

Примечание. *Различие значимо с учётом поправки Бонферрони.

 

По сравнению с группой контроля у пациентов с РС выявлено существенное (p < 0,05) увеличение содержания В-клеток памяти (CD19+CD27+), а также активированных по антигенам CD38 и CD25 В-лимфоцитов.

Через 6 мес после 1-го курса анти-CD20-МАТ у пациентов с РС отмечено значительное (p < 0,05) увеличение в циркуляции относительного содержания CD5+-В-лимфоцитов и существенное (p < 0,05) снижение содержания В-клеток памяти (CD27+), а также В-клеток, экспрессирующих костимулирующие и активационные молекулы (CD40, CD38, CD25).

Выраженное увеличение экспрессии антигенов CD95 и CD5 на В-клетках по сравнению с исходной (p < 0,05) может свидетельствовать о недостаточном эффекте однократного введения анти-CD20-МАТ и о высокой вероятности обострения заболевания в последующем.

Мы изучили влияние различных видов ПИТРС на особенности экспрессии молекулы HLA-DR на моноцитах ПК у больных РС. Достоверных различий в содержании моноцитов, экспрессирующих HLA-DR, у наивных пациентов с агрессивным течением РС и у всех групп больных на терапии ПИТРС по сравнению со здоровыми испытуемыми не выявлено (табл. 3). Показатель MFI HLA-DR у наивных больных с РС и пациентов, получавших интерферон-β и натализумаб, не отличался от показателей здоровых лиц. И только для группы пациентов, получивших 1-й курс анти-CD20-МАТ, обнаружено значительное снижение MFI HLA-DR по сравнению со здоровыми лицами, что даёт основание предполагать, что анти-CD20-МАТ оказывает опосредованное воздействие на моноциты ПК, подавляя их антигенпрезентирующую способность.

 

Таблица 3. Особенности экспрессии HLA-DR на моноцитах ПК, Ме [Q1; Q3]

Показатель	Здоровые добровольцы (n = 10)	Наивные пациенты с агрессивным течением РС (n = 2)	Пациенты, получавшие интерферон-β (n = 6)	Пациенты, получавшие натализумаб (n = 19)	Пациенты, получившие 1-й курс анти-CD20-МАТ (n = 29)	p
	1	2	4	4	5
Моноциты CD14+ HLA-DR+, % клеток	95,4 [93, 1; 100, 0]	96,1 [89, 7; 97, 1]	94,8 [90, 4; 96, 7]	92,4 [86, 9; 96, 0]	91,0 [81, 4; 94, 6]	p 1-2 = 0,152 p 1-3 = 0,101 p 1-4 = 0,123 p 1-5 = 0,082
MFI HLA-DR, усл. ед.	230,4 [198, 0; 261, 7]	186,1 [115, 0; 256, 3]	207,3 [83, 8; 263, 3]	160,2 [126, 1; 227, 6]	111,6 [100, 4; 139, 5]	p 1-2 = 0,148 p 1-3 = 0,179 p 1-4 = 0,137 p 1-5 = 0,008*

Примечание. *Различие значимо с учётом поправки Бонферрони.

 

Исследуемую группу пациентов (n = 29) продолжали наблюдать в течение 24 мес, когда они получали последующие курсы анти-CD20-МАТ в дозе 600 мг через 6, 12, 18 и 24 мес после 1-го курса введения препарата.

Активность на МРТ зарегистрирована у 7 (24,13%) пациентов, причём у 1 пациентки гадолиний-позитивные очаги (Gd+) выявлялись через 6 и 12 мес терапии. При оценке динамики МРТ Gd+-очаги выявлялись у 2 пациентов через 6 мес, у 3 — через 12 мес, у 1 — через 24 мес. Новые очаги, не накапливающие контрастное вещество, у 1 пациента обнаружены через 12 мес, ещё у 1 — через 24 мес.

В результате исследования клинических данных, характера течения заболевания и показателей клеточного иммунитета у обследованных больных до и через 6 мес после начала терапии анти-CD20-МАТ выявлены изменения субпопуляций лимфоцитов ПК, которые можно интерпретировать как факторы риска активности РС в последующие 2 года. Значимым фактором, связанным с активностью на МРТ в первые 6 мес терапии, является повышение относительного содержания CD3+-Т-лимфоцитов при повторном исследовании (p = 0,014 с точностью прогноза 68,2%). Не определены как значимые факторы уровень снижения CD19+ и CD20+ (p = 0,09).

Через 12 мес от старта терапии активность при МРТ с вероятностью прогноза более 90% выявлена у пациентов, у которых после 1-го курса анти-CD20-МАТ было отмечено повышение уровня CD25+CD3+ (p = 0,007), CD95+CD3+ (p = 0,046), CD40+CD19+ (p = 0,000), CD5+CD19+

(p = 0,003), CD38+CD19+ (p = 0,001) при снижении уровня CD95+CD19+-лимфоцитов (p = 0,001). Соответствующих значимых биомаркеров появления активности по МРТ через 24 мес в данном исследовании не определено, что, вероятно, обусловлено изменениями ПК в результате последующих курсов анти-В-клеточной терапии.

У 5 (17,24%) пациентов диагностировано обострение,

у 1 (3,44%) пациентки — через 6 и 12 мес терапии. Значимым фактором риска обострений через 6 мес после начала лечения с вероятностью 90,9% оказался повышенный уровень активированных CD3+HLA-DR+-лимфоцитов (p = 0,02).

В течение 12 мес после начала терапии риск обострений возрастал с вероятностью более 90% при повышенном уровне CD25+CD3+- (p = 0,01), CD95+CD3+- (p = 0,05), CD40+CD19+- (p = 0,000), CD5+CD19+- (p = 0,003), CD38+CD19+-клеток (p = 0,001) при снижении уровня CD95+CD19+-клеток (p = 0,001), см. рисунок. Значимых биомаркеров вероятного обострения через 24 мес в данном исследовании не выявлено.

 

Показатели иммунного статуса у пациентов с РС.

1 — CD25+CD3+ исходно; 2 — CD25+CD3+ через 6 мес; 3 — CD95+CD3+ исходно; 4 — CD95+CD3+ через 6 мес; 5 — CD40+CD19+ исходно; 6 — CD40+CD19+ через 6 мес; 7 — CD5+CD19+ исходно; 8 — CD5+CD19+ через 6 мес; 9 — CD38+CD19+ исходно; 10 — CD38+CD19+ через 6 мес; 11 — CD95+CD19+ исходно; 12 — CD95+CD19+ через 6 мес. Синие столбики — пациенты без обострений, красные — пациенты, перенёсшие обострение в срок до 12 мес после 1-го введения МАТ.

 

У 4 (13,7%) пациентов зафиксировано прогрессирование РС, из них у 3 (10,3%) — в течение 1 года терапии, у 1 (3,4%) — на 2-м году лечения. Значимых изменений показателей иммунного статуса после 1-го курса терапии анти-CD20-МАТ как факторов прогрессии заболевания в дальнейшем не обнаружено.

Обсуждение

Результаты многочисленных экспериментальных и клинических исследований клеточного иммунитета у пациентов с РС показали высокую степень вариабельности всех изученных субпопуляций лимфоцитов, особенно на фоне терапии ПИТРС по сравнению с пациентами без лечения [14, 15, 18]. Обнаружено провоспалительное энцефалитогенное действие CD8+-Т-клеток, возрастающее при контакте с молекулами основного белка миелина [16], снижение содержания Т-лимфоцитов (CD3+) и Т-хелперных лимфоцитов (CD4+), в том числе активированных (CD4+HLA-DR+), а также увеличение доли NKT-клеток (CD3+CD16+CD56+). Выявлено повышенное количество активированных цитотоксических CD8+-Т-лимфоцитов, что позволяет предположить их важную роль в развитии РС [17].

В ходе нашего исследования обнаружено, что значимыми изменениями исходных параметров клеточного иммунитета у пациентов с РС по сравнению со здоровыми добровольцами были выраженное увеличение относительного, но не абсолютного количества Т-хелперных лимфоцитов, снижение относительного числа Т-цитотоксических и NKT-лимфоцитов, а также снижение абсолютного числа NK-лимфоцитов и уровня активированных (CD3+HLA-DR+) Т-лимфоцитов. У данных пациентов выявлено существенное увеличение содержания В-клеток памяти (CD19+CD27+), а также активированных по антигенам CD38- и CD25 В-лимфоцитов. Эти изменения коррелировали с клинической картиной — у 20 (71,3%) пациентов на момент включения в исследуемую группу отмечалось обострение РС за предшествующие 12 мес. Всем обследованным пациентам с РС требовалась коррекция терапии.

Группа пациентов, получивших 1-й курс анти-CD20-МАТ, была крайне неоднородна по степени восстановления количественных параметров популяции В-лимфоцитов: у 85% пациентов не произошло нормализации количества В-лимфоцитов к моменту 2-го введения анти-CD20-МАТ через 6 мес.

Через 6 мес после 1-го курса анти-В-клеточной терапии у пациентов на фоне более чем 10-кратного снижения абсолютного и относительного количества В-лимфоцитов наблюдалось также снижение общего количества лимфоцитов в ПК за счёт абсолютных значений Т-популяции и Т-хелперной субпопуляции, хотя их относительные величины были повышены. Отмечено также выраженное снижение абсолютного количества NK-клеток и доли NKT-лимфоцитов, ещё более низкий уровень активированных Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR+), существенное снижение содержания В-клеток памяти (CD27+), в том числе основного пула В-лимфоцитов, экспрессирующих костимулирующие и активационные молекулы (CD40, CD38, CD25). Таким образом, у больных РС после применения даже 1-го курса анти-CD20-МАТ отмечено выраженное снижение абсолютных значений основных иммунокомпетентных клеток в ПК — как Т-, так и NK-лимфоцитов, а также ингибирование активационного потенциала Т- и В-лимфоцитов, в том числе их способности к ангигенпрезентации.

Взаимодействие костимулирующей молекулы CD40 на В-лимфоцитах со своим лигандом CD40L (СD154) на Т-лимфоцитах дополнительно стимулирует запуск иммунного ответа и способствует активации В-лимфоцитов для продукции антител [18]. Обнаружение CD40 на B-клетках в воспалительных очагах центральной нервной системы умерших пациентов с РС позволяет предположить, что продукция антител через взаимодействие CD40 между Т- и В-клетками может способствовать развитию этой патологии [19]. Снижение содержания CD40+-В-лимфоцитов при терапии анти-CD20-МАТ может свидетельствовать о сниженной способности к запуску иммунного ответа этих клеток. Следовательно, можно заключить, что антиCD20-МАТ не только напрямую влияло на зрелые CD20+- В-лимфоциты, но и опосредованно воздействовало на костимулирующую молекулу на этих клетках, тем самым оказывая влияние и на Т-клеточное звено.

Более того, при исследовании экспрессии HLA-DR на моноцитах ПК у данной группы пациентов было детектировано значительное снижение плотности данной молекулы по параметру MFI, что может свидетельствовать о подавлении антигенпрезентирующей способности моноцитарно-макрофагального звена иммунитета. Макрофаги и микроглия могут выступать в качестве антигенпрезентирующих клеток при нейровоспалении и поражениях центральной нервной системы при РС, способствовать активации эффекторных лимфоцитов, тем самым инициировать специфический иммунный ответ [20]. Участие макрофагов в патогенезе РС может быть ещё одним фактором, влияющим на прогрессирование заболевания. Моноциты ПК — это клетки врождённого иммунитета, которые при миграции в ткани дифференцируются в тканевые макрофаги и являются специализированными антигенпрезентирующими клетками за счёт экспрессии на них антигенов главного комплекса гистосовместимости 2-го класса, которая усиливается при активации клеток. Презентация антигена — центральное событие иммунного ответа, связывающее реакции врождённого и адаптивного иммунитета [21]. Именно поэтому изучение антигенпрезентирующей способности моноцитов может играть существенную роль в расширении представлений об иммунопатогенезе РС.

Клинические и экспериментальные данные свидетельствуют о том, что моноциты с низкой либо отсутствующей экспрессией молекул HLA-DR на своей поверхности не могут выполнять в полной мере свою антигенпрезентирующую функцию и не способны продуцировать воспалительные медиаторы в ответ на соответствующие стимулы [23].

По данным некоторых публикаций, уменьшение экспрессии HLA-DR на моноцитах коррелировало с высоким риском инфекционных осложнений у пациентов с травмой, ожогами, при панкреатите, сепсисе, после трансплантации органов и операций на сердце и сосудах [24–28].

Статистическими методами определены корреляции между изменениями количественных показателей субпопуляционного состава Т-и В-лимфоцитов и значимыми факторами риска дальнейшего неблагоприятного течения РС в отдалённом периоде. Такими показателями явились увеличение содержания популяции CD3+, субпопуляций CD3+HLA-DR+, CD25+CD3+, CD95+CD3+,

CD40+CD19+, CD5+CD19+, CD38+CD19+, снижение уровня CD95+CD19+. Таким образом, увеличение активационного потенциала Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и снижение степени готовности к апоптозу В-лимфоцитов — это значимые факторы риска для развития обострения заболевания и выявления МРТ-признаков активности при дальнейшем течении РС. 

Заключение

Проведение 1-го курса анти-CD20-МАТ продемонстрировало низкую степень восстановления количественных параметров популяции В-лимфоцитов у 85% пациентов через 6 мес. Выявлено не только относительное увеличение доли общих Т-лимфоцитов в результате деплеции В-лимфоцитов, но и выраженное снижение абсолютных значений основных параметров Т- и NK-клеточного иммунитета, значительное снижение числа активированных Т- и В-лимфоцитов, что может свидетельствовать о недостаточном потенциале восстанавливающихся В-лимфоцитов к ангигенпрезентации и полноценному запуску иммунного ответа.

Именно после 1-го введения анти-CD20-МАТ выявлено подавление антигенпрезентирующей способности моноцитарно-макрофагального звена иммунитета, что, по нашим данным, не наблюдалось у наивных пациентов с агрессивным течением и при применении других видов ПИТРС. Эти факты могут свидетельствовать о высокой эффективности проведения 1-го курса анти-CD20-МАТ, что в дальнейшем потребует более глубокого корреляционного анализа с клиническими особенностями пациентов данной группы.

Дополнительными иммунологическими критериями прогнозирования обострения РС и активности по МРТ в 1-й год терапии могут служить изменения по сравнению с исходными показателями следующих иммунологических параметров: увеличение содержания популяции CD3+, субпопуляций CD3+HLA-DR+, CD25+CD3+, CD95+CD3+,

CD40+CD19+, CD5+CD19+, CD38+CD19+, снижение уровня CD95+CD19+-лимфоцитов.

При дальнейшем изучении биомаркеров появится возможность ранней коррекции терапии РС, направленной на стабилизацию состояния пациента.

 

¹ Рассеянный склероз. Клинические рекомендации, 2025. URL: https://cr.minzdrav.gov.ru/clin-rec (дата обращения: 01.08.2025).

² Рассеянный склероз. Клинические рекомендации, 2025. URL: https://cr.minzdrav.gov.ru/clin-rec

About the authors

Yuliana A. Belova

M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research and Clinical Institute

Author for correspondence.
Email: juliannabelova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1509-9608

Cand. Sci. (Med.), senior researcher, Neurological department

Russian Federation, Bld. 10, 61/2, Shchepkina str., Moscow, 129110

Yulia Yu. Chuksina

M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research and Clinical Institute

Email: tchuxina2009@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4393-1759

Cand. Sci. (Med.), senior researcher, Laboratory of biomedical research methods

Russian Federation, Moscow

Sergey V. Kotov

M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research and Clinical Institute

Email: kotovsv@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8706-7317

D. Sci. (Med.), Professor, Head, Department of neurology, Faculty of advanced training for doctors; Head, Neurological department

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files